[发明专利]斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.制备权利要求1所述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的方法，其特征在于，依次包括下述方法：

1)总RNA的提取

对斑节对虾解剖并取出肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃组织，并分别将各组织溶于Trizol中匀浆，提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，保存；

2)cDNA第一链的合成

将步骤1)中的斑节对虾总RNA与反转录引物混合，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链；

3)斑节对虾细胞周期蛋白H基因的PCR扩增、克隆

以步骤2)合成的第一链cDNA作为模板利用降落PCR法，用接头引物和cycH-F1、cycH-F2对目的基因的3ˊ末端进行两次PCR扩增得PCR产物；

4)对斑节对虾细胞周期蛋白H基因的测定

对步骤3)所得到的PCR产物分离检测、纯化后，再将PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，测序；

5)斑节对虾细胞周期蛋白H基因的分布和表达

a)提取斑节对虾不同组织以及不同发育时期的卵巢的总RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手册进行反转录为cDNA模板；将不同组织样品cDNA稀释作为模板，采用SYBR Green Ⅰ染料法，在Eppendorf荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析；

b)依照TaKaRaPrimeScriptTM RTPCR Kit试剂盒说明书进行PCR反应，实验数据采用相对ΔCT法分析斑节对虾细胞周期蛋白H基因在各样品中的相对表达量。

3.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的反转录引物为：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3。

4.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的反转录酶为M-MLV。

5.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的反应条件：42℃60min，70℃15min。

6.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，其特征在于，步骤3)所述的接头引物为：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC<3。

7.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，其特征在于，步骤3)所述的cycH-F1为：5>AACCATTCCGCCCAGTAGAAG<3；

cycH-F2为：5>AACCTCCTGCCTCGGACACT<3。

8.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，其特征在于，步骤3)中两次扩增所述的反应条件均为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，45s，35cycles；72℃，60s；72℃，10min。

9.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，其特征在于，步骤b)中PCR反应使用引物为：

RTCYCH-F：5>CGTGAGATTGAAGGCAAGTTAGA<3；

RTCYCH-R：5>GCTTCCCCAATGCAGGAA<3。

10.权利要求1所述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列作为设计抗肿瘤药物的靶位点或者调节斑节对虾卵巢发育过程。