[发明专利]一个高产药用天然产物的硬紫草转LeEIL-1基因毛状根株系

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及将携带目的基因的植物表达载体转入发根农杆菌，然后再侵染硬紫草无菌苗而诱导出转基因的毛状根株系。 

背景技术

硬紫草(Lithospermum erythrorhizon sieb.et zucc)是我国一种重要的药用植物，其根部可合成紫红色的萘醌类药用天然产物——紫草宁及其衍生物(以下简称紫草宁)，这类物质具有抗菌、消炎、活血等功效，而且还是一种珍贵的天然色素，可以广泛用于食品、高级化妆品、日化产品与塑料制品的着色等^[1-3]。近年来国内外的研究还发现紫草宁通过活化Caspase-3和抑制拓扑异构酶活性来诱导癌细胞凋亡，被认为是继喜树碱、紫杉醇之后又一类极具潜力的天然抗菌消炎、抗肿瘤、抑制HIV病毒等多种药理活性的药物^[4-6]。 

在我国有新疆紫草、东北硬紫草、内蒙紫草、滇紫草、广西紫草等分布于相应地区。近年来，随着东北长白山脉及内蒙古草原地带的对人为过度开发利用及放牧，以及自然生态环境日渐恶化，作为重要紫草种类的硬紫草，其野生紫草资源日趋枯竭。 

随着现代生物技术的发展，采用生物工程学手段生产人类所需的紫草宁，成为一种非常重要的替代手段。上世纪70年代，日本即已成功利用两阶段培养法，即在光照条件下B5固体培养基上繁殖紫草细胞，然后在黑暗条件下利用M9液体生产培养基中培养紫草细胞进行工业化生产紫草宁，紫草也从而成为世界上第一个采用细胞培养体系来商业化生产药用天然产物的药用植物^[7]。但在实践过程中发现，用细胞生产紫草宁存在诱导愈伤细胞困难、细胞易于老化褐化、紫草宁产量不高、产量不稳定、夏季难产或不产紫草宁等诸多问题。 

发根农杆菌是在植物基因工程中广泛应用的一种侵染性很强的根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，其携带的Ri质粒能有效侵染绝大多数双子叶植物，少数单子叶植物以及个别裸子植物，诱发植物产生形状如根系的发根即毛状根(hairy root)。由于发根农杆菌转化的毛状根具有生长速度快、分支多，能够持续合成次生代谢产物，获得的次生代谢产物量高且稳定、不需要添加外源植物激素等特点，因此可作为生产和研究植物次生代谢物质的生物反应器；同时，由于发根农杆菌携带的Ri质粒能将外源基因整合到寄主染色体、其诱导产生的毛状根易获得再生植株等优点，因此，建立特定植物的转基因毛状根体系，在定向分子育种方面具有广泛应用前景。近年来利用发根农杆菌已转化大约160多种植物，在40多种植物建立了毛 状根培养体系，特别是一些药用植物建立了毛状根转基因体系，极大地方便了药用天然产物生产及遗传育种研究。 

紫草宁的合成受到多种物理和化学因素的影响，如光、无机盐离子、植物激素(乙烯和茉莉酸等)^[8-10]。乙烯是一种能调控植物生长发育、抗逆境胁迫反应等多个方面的气态类激素，通过改变乙烯浓度，或者改变植物乙烯信号传导途径中关键靶标基因的表达，可以改变植物对天然产物的合成调控，如改变烟草ERF189及ERF163表达，可直接促进烟草生物碱的合成^[11]；研究表明，乙烯同样参与紫草宁的合成调控^[12]。 

紫草的LeEIL-1(L.erythrorhizon EIN3-like protein 1)基因编码EIN3转录因子家族蛋白LeEIL-1。EIN3/EIL1是乙烯信号传导途径中的关键转录因子，在乙烯介导的植物生长发育及代谢调控中起重要作用。紫草细胞从B5转入M9中后，LeEIL-1受诱导表达，并且在紫草根部(紫草宁合成的特异性部位)高表达，推测该基因参与乙烯介导的对紫草宁的合成调控^[13]。 

通过转基因技术将紫草本身的LeEIL-1基因转入紫草中过表达，改变紫草细胞中内源乙烯对紫草宁的合成调控，从中筛选出高产药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系，在理论上是完全可行的。 

通过转基因技术获得高产药用天然产物的紫草毛状根株系，不仅在系统研究紫草药用天然产物生物合成途径及其分子调控机制方面具有重要的理论意义，并在商业化生产紫草药用天然产物方面具有非常重要的应用前景和价值。尽管目前国内外有利用毛状根为材料对紫草宁合成调控进行的相关研究，但并无将紫草EIN3/EIL1家族蛋白的相关基因转入发根农杆菌，诱导出能高效合成紫草药用天然产物的紫草转基因毛状根并藉此提高紫草宁合成的相关报道。 

发明内容