[发明专利]一种纳米材料整体柱固载酶生物微反应器的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及整体柱固载酶生物微反应器的制备及其应用，具体是一种基于纳米材料为中间配体的多孔有机聚合物整体柱固载酶生物微反应器的制备方法，并研究其在蛋白质组学分析、药物手性拆分和催化酯交换反应中的应用。 

背景技术

酶固定化技术是一门交叉学科技术。固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又具有更高的酶/底物比和酶解效率、更快的酶解速率、可连续使用并能减少酶的自身降解和交叉感染等优点；且酶解反应可控，酶与产物易于分开，产物容易提纯，反应所需的空间小，可以实现和分离鉴定系统的联用。固定化酶的性能主要取决于固定化方法和所使用的载体材料，二者能直接影响固定化酶的催化活性。然而目前国内外报道的固定化载体和方法均有一定的局限性，如二氧化硅、人工合成微粒、介孔分子筛、大孔树脂和合成纤维等载体对酶的固载量较低，且传质速度慢，不利于快速高效的进行酶催化反应。而常规的酶固定化方法，如包埋法、交联法、共价结合、离子结合和物理吸附等均具有一定的缺陷。例如，离子结合法和物理吸附法制备简单、活力回收率高、载体可以再生，然而酶的固定化程度较弱，催化过程中酶容易脱落。共价结合法、交联法和包埋法对酶的固定化程度强，然而制备较难、活力回收率低、载体不能再生。因此，目前迫切需要开发酶固定化载体和固定化方法，增强酶的催化活性，增大使用寿命和可再生性，提高酶解反应的反应速率和效率。 

有机高聚物整体柱具有制备简单、渗透性好、背压低、传质速度快、易于改性和化学稳定性高等优点，可以为酶和底物提供快速的对流传质性能，因而是固定化酶的理想载体之一。例如Krenkova和Urban等人(Anal.Chem.2009，81，2004-2012；Biotechnology and Bioengineering，2012，109，371-380)分别应用环氧基团或吖内酯基团与酶的氨基反应，通过共价法在整体柱上固载酶，分别用于蛋白质组学分析和催化酯交换反应。Spross(Anal.Chem.2010，82，1434-1443)则利用戊二醛交联法在整体柱上固载酶，用于蛋白质消化。Ma，Wu和Zhang等人(Proteomics 2011，11，991-995；J.Chromatogr.A 2012，1256，136-143；Anal.Bioanal.Chem.2012，402，703-710)分别通过金属离子螯合和离子键固载酶，酶解蛋 白质，进行蛋白质组学分析。整体柱固载酶生物微反应器虽然能为酶和底物提供良好的对流传质性能，提高酶解反应速率，但是使用过程中仍然存在两个问题，一是整体柱由于具有连续的贯穿大孔，其比表面积较小，因此酶固载量较低。二是传统的整体柱固载酶方法，如共价法和离子交换法等存在一定的弊端，不利于提高酶的稳定性和使用寿命。 

纳米材料由于其独特的尺寸和物理性质，比如具有小粒径效应、表面效应及界面效应等，具有比表面积大等诸多优点。作为载体用于酶的固定化，有利于保持酶的活性和稳定性，大大提高酶的固载量和催化效率。本专利中将纳米材料和整体柱相结合，首先对整体柱聚合物进行功能化修饰，键合纳米材料；再以纳米材料为中间配体，通过开发纳米材料与酶的亲和超分子识别作用实现酶的固定化，合成纳米材料整体柱固定化酶生物微反应器。有机聚合物整体柱化学稳定性高，通透性好，能为酶和底物提供快速的对流传质性能。纳米材料巨大的比表面积与体积比，有利于大大提高酶的固载量；亲和作用力强，能防止酶从载体上的脱落；且反应条件温和，可以保持酶的三维结构和生物活性。将二者有机结合，一方面可以解决传统固载酶生物微反应器传质速率慢、固载量低和催化效率低等问题，大大提高固载酶的稳定性、使用寿命、催化速率和效率；另一方面亲和超分子作用力可逆，酶在多次使用失活后可洗脱，重新键合新酶，固载酶反应器可再生，大大降低了成本，为固载酶生物微反应器的制备提供新方法。 

发明内容：

本发明的目的之一是研究一种纳米材料整体柱固载酶微生物微反应器，通过将纳米材料和整体柱二者有机结合，解决传统固载酶生物微反应器传质速率慢、酶固载量低、催化效率低和使用寿命差等问题，从而获得催化速率快、效率高的可再生固载酶生物微反应器。 

本发明的目的之二是研究纳米材料整体柱固载酶生物微反应器在催化酯交换反应、药物手性拆分和蛋白质组学分析中的应用，实现酶催化反应的快速、高效进行。