[发明专利]一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括酶标板、氯霉素标准品、氯霉素抗体工作液、氯霉素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液。

2.一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、氯霉素标准品的制备、氯霉素抗体工作液的制备、氯霉素酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩复溶液的制备和浓缩洗涤液的制备。

3.根据权利要求2所述的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的酶标板制备方法为将氯霉素半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到氯霉素包被抗原，用0.05mol/LpH7.2的磷酸盐(PBS)缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释成1：60000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150μL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

4.根据权利要求2所述的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：氯霉素标准品的浓度分别为0ng/mL、0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.09ng/mL、0.81ng/mL、2.43ng/mL。

5.根据权利要求2所述的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的氯霉素抗体工作液是采用氯霉素人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：80000比例制备。

6.根据权利要求2所述的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的氯霉素酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：4000比例，所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸，所述浓缩复溶液是10倍浓缩复溶液，其为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其为含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

7.权利要求2所述的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法的特征在于：预处理待测样品，取包被有氯霉素抗原的酶标板，按序分别加入标准品/样本、氯霉素抗体工作液各50μL/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min，将孔内液体甩干，用洗涤工作液充分洗涤4~5次，每次间隔10s，拍干后加入氯霉素酶标二抗工作液100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min，将孔内液体甩干，相同方法洗涤，拍干后加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min，加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据），以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中氯霉素的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述待测样品用以下方法进行预处理：

牛奶：将牛奶离心去除上层脂肪，取2mL已去除脂肪的牛奶样本加入4mL乙酸乙酯，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测；

组织：准确称取2g均值后的样品于离心管中，先加入2mL去离子水充分混匀再加入4mL乙酸乙酯，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测；

血清：取2mL血清加入4mL乙酸乙酯涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL样品复溶液混匀待测；

蜂蜜：准确称取2g样品于离心管中，加人2mL去离子水，涡旋混合至试样完全溶解后加人4mL乙酸乙醋，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测。