[发明专利]一种由CS/SiO2超薄膜构筑的块体大孔复合材料固定化漆酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种由CS/SiO₂超薄膜构筑的块体大孔复合材料固定化漆酶的制备方法。

背景技术

漆酶是一种含铜多酚氧化酶，广泛存在于多种生物体内。漆酶具有宽泛的底物专一性和较好的稳定性，能催化氧化多种难降解有机污染物，包括酚类化合物、多环芳烃、多氯联苯及其衍生物、除草剂、杀虫剂等，它在废水处理、生物传感器构建、生物制浆、食品加工以及有机合成等方面有重要应用价值。因此，国内外科学家在生物、化学、物理、医学等多领域对漆酶开展了广泛的研究工作。

游离的漆酶因在使用过程中易随环境的变化变性失活、易混入产品和不易循环利用等使其应用受到限制。对漆酶进行固定化是实现其重复利用、改善其稳定性的有效方法。固定化漆酶是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机载体上，形成不溶于水的具有酶活性的衍生物，在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。

漆酶固定化的方法主要有物理方法和化学方法两种。物理方法主要有吸附法、包埋法和离子交换法，化学方法主要有共价结合法和交联结合法。近年来国际上对漆酶的固定化进行了较为广泛的研究，使用的载体包括壳聚糖、亲水性微滤膜、SiO₂纳米颗粒、介孔SiO₂和介孔碳等多种材料。但是现有的固定化漆酶普遍存在着生产成本高、制备工艺复杂、分离效果差、重复使用率低等缺点。

复合材料是由两种或两种以上不同性质的材料通过物理或化学的方法，在宏观上组成具有新性能的材料。各种材料在性能上互相取长补短，产生协同效应，使复合材料的综合性能优于原组成材料而满足各种不同的要求。壳聚糖的分子结构中含有大量自由的氨基和羟基，因此壳聚糖具有聚阳离子、螯合、易成膜、pH敏感、湿度敏感等性质和较高的化学活泼性，其分子中大量的氨基和羟基能与大孔二氧化硅材料中的羟基形成氢键，可以很好地吸附在SiO₂大孔材料孔壁表面成膜，形成有机-无机大孔复合材料。将该材料用于固定化漆酶，可体现其优异的性能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以CS/SiO₂超薄膜构筑的块体大孔复合材料为载体的固定化漆酶及其制备方法。

本发明所提供的固定化漆酶的制备方法是，以我们前期制备的块体(长、宽、高为0.2～0.4cm)SiO₂大孔材料(RuifengZhang，NengbingLong，LeleZhang，ThinSolidFilms，517(2009)，6677-6680)为原料；利用该大孔材料具有稳定的骨架结构、孔径大、传质效率高、孔道表面含有丰富的羟基等诸多特点，采用物理吸附法将壳聚糖吸附在SiO₂大孔材料孔壁表面，再用双功能交联剂交联壳聚糖大分子，形成一种由CS/SiO₂超薄膜构筑的块体大孔复合材料。以所制备的大孔复合材料为载体，将漆酶通过物理吸附作用固定在该载体上。具体制备方法如下：

(1)载体的制备：称取一定质量的壳聚糖溶于质量分数为1～3％的乙酸溶液中，配制成质量分数为0.5～5％的壳聚糖溶液；称取所需干燥的块体SiO₂大孔材料浸入壳聚糖溶液中，在室温下振荡1～12h，滤出大孔材料、真空干燥；先用碱溶液反复冲洗、再用蒸馏水反复冲洗，50～80℃下干燥2h；将干燥的大孔材料浸入含双功能交联剂质量分数为1～3％的溶液中振荡反应3～12h，滤出大孔材料、用蒸馏水反复冲洗、真空干燥，即得固定化酶所用的载体。

(2)漆酶的固定：将步骤(1)中得到的载体浸入用缓冲溶液配制的漆酶溶液中，在5～30℃下振荡2～12小时，滤出、用缓冲液洗涤至溶液中检测不到蛋白，然后真空干燥即得固定化漆酶成品。

步骤(1)中所述的碱溶液为氨水或碳酸钠水溶液中的一种；所述的双功能交联剂为戊二醛、乙二醛、乙二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚中的一种。

步骤(2)中所述的漆酶溶液的浓度为1～80mg·ml^-1、pH值为2～7；缓冲溶液可以是醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐中的一种或两种。