[发明专利]一株枯草芽孢杆菌AP139及其发酵菌剂和它们的应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物杀菌剂领域，更具体涉及一种枯草芽孢杆菌AP139及其发酵菌剂，同时还涉及它们在制备抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种制剂中的应用。 

背景技术

多杀性巴氏杆菌是畜、禽、野生动物和人类的一种重要共患性病原，主要通过呼吸道传播，可引起禽霍乱、猪肺疫和牛出血型败血症等，是养殖场一种非常常见的呼吸道传染性疾病，在无抗生素使用的条件下发病率较高。巴氏杆菌在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中均有存在，养殖场环境中存在多种巴氏杆菌，空气中一定滴度的巴氏杆菌在适宜的条件下致病。 

随着畜禽养殖集约化和规模化程度不断提高，养殖场空气质量逐渐降低，巴氏杆菌引起动物发病的概率和损害程度不断增加。目前，养殖场对巴氏杆菌引起的疾病进行控制主要通过抗生素进行预防和治疗。然而，抗生素的大量使用引起内源性感染和二重感染、耐药菌株的产生、畜禽免疫力下降和畜产品及环境中残留引起二次污染等一系列严重问题，很多国家和地区比如欧盟和韩国都已经禁止使用抗生素。因此，如何在对人和环境影响较小或不影响的条件下，有效预防巴氏杆菌的感染与传播，是一个急需解决的问题。 

本发明研制的枯草芽孢杆菌AP139及其发酵菌剂能抑制养殖舍中巴氏杆 菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的生长繁殖，尤其是巴氏杆菌，降低了养殖场由巴氏杆菌引起的发病率，具有良好的应用前景和重大的经济及社会意义。 

发明内容

本发明的主要目的是在于提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139及其发酵菌剂和它们的应用方法，该菌株及其菌剂能显著的抑制养殖舍中巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种的生长繁殖，尤其是巴氏杆菌，降低了养殖场由巴氏杆菌引起的发病率。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 

一株保藏编号为CCTCC NO：M2014053的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139。 

所述的枯草芽孢杆菌AP139的发酵菌剂，是由以下方法制备而成的： 

第一步：所述的枯草芽孢杆菌AP139在LB固体培养基上进行划线培养，培养温度30-37℃，培养时间18-36h； 

第二步：从第一步的LB固体培养基上挑取枯草芽孢杆菌AP139单个克隆株至装有20-40％容积LB液体培养基的10ml EP管中，培养温度为30-37℃，转速为150-225r/min，培养时间18-36h；然后用LB液体培养基调整细菌浓度为1×10⁹-10¹⁰CFU/ml，取3-5ml接种于100mlLB液体培养基中，在摇床中进行培养，培养温度30-37℃，转速150-225r/min，培养时间18-36h； 

第三步：取第二步所得到的枯草芽孢杆菌AP139液体摇瓶培养液，按照3-5％体积接种量，接种到10L发酵罐中，发酵条件为：装液量4-7L的LB液体培养 基，发酵温度25-40℃，pH值6.8-7.8，发酵时间18-36h，转速，200-400r/min。 

所述的枯草芽孢杆菌用于抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种，优选用于抑制巴氏杆菌。 

所述的枯草芽孢杆菌用于制备抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种的制剂，优选用于制备抑制巴氏杆菌的制剂。 

所述的枯草芽孢杆菌用于制备养殖舍消毒的制剂，或者动物饲料的添加剂。 

所述的枯草芽孢杆菌AP139的发酵菌剂也用于抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种，优选用于抑制巴氏杆菌。 

所述的枯草芽孢杆菌AP139的发酵菌剂也用于制备抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种的制剂，优选用于制备抑制巴氏杆菌的制剂。 

所述的枯草芽孢杆菌AP139的发酵菌剂也用于制备养殖舍消毒的制剂，或者动物饲料的添加剂。 

所述的枯草芽孢杆菌AP139的发酵菌剂的应用方法具体是将所述菌株的发酵菌剂先制备成1×10⁸-1×10⁹CFU/mL的溶液，LB液体培养基500-3000倍稀释后在养殖舍中进行喷雾，使得喷雾后养殖舍枯草芽孢杆菌AP139的浓度为1×10⁵-1×10⁶CFU/m³。