[发明专利]一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用

权利要求书

1.一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：

蔗糖30-90mmol

海藻糖15-45mmol

三羟甲基氨基甲烷20-40mmol

氯化钾0.5-2mmol

还原型谷胱甘肽3.2-9.8mmol

甲醇0.08-0.2L

其余为去离子水

加入甲醇之前的溶液渗透压为69.2-188.8mOsM，冷冻保存液的pH为7.4-8.6。

2.一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：

蔗糖40-80mmol

海藻糖20-40mmol

三羟甲基氨基甲烷22.5-37.5mmol

氯化钾0.75-1.5mmol

还原型谷胱甘肽5-8mmol

甲醇0.085-0.15L

其余为去离子水

加入甲醇之前的溶液渗透压为89-168.5mOsM，冷冻保存液的pH为7.6-8.4。

3.一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：

蔗糖50-70mmol

海藻糖25-35mmol

三羟甲基氨基甲烷25-35mmol

氯化钾0.8-1.3mmol

还原型谷胱甘肽5.5-7.5mmol

甲醇0.09-0.13L

其余为去离子水

加入甲醇之前的溶液渗透压为107.1-150.1mOsM，冷冻保存液的pH为7.8-8.2。

4.一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：

蔗糖55-65mmol

海藻糖27.5-32.5mmol

三羟甲基氨基甲烷25-35mmol

氯化钾0.9-1.1mmol

还原型谷胱甘肽6-7mmol

甲醇0.095-0.11L

其余为去离子水

加入甲醇之前的溶液渗透压为117.8-139.2mOsM，冷冻保存液的pH为7.9-8.1。

5.一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：

蔗糖60mmol

海藻糖30mmol

三羟甲基氨基甲烷30mmol

氯化钾1mmol

还原型谷胱甘肽6.4mmol

甲醇0.1L

其余为去离子水

加入甲醇之前的溶液渗透压为128.4mOsM，冷冻保存液的pH为8.0。

6.权利要求1所述的一种达氏鲟精子冷冻保存液的制备方法，其步骤如下：

1）根据总精液量计算需要冷冻保存液的总体积；

2）根据冷冻保存液的总体积和各组分的配方浓度以及各组分贮备液的浓度，计算各组分贮备液的量取体积，计算公式为：各组分量取体积＝各组分的配方浓度×冷冻保存液总体积÷各组分贮备液的浓度，用微量取样器从各组分贮备液中量取相应的体积并混匀，最后加蒸馏水至冷冻保存液的终体积；

3）从上述溶液中量取出冷冻保存液总体积×甲醇浓度的体积溶液，再加入等量的甲醇混匀配制成最终的精子冷冻保存液。

7.权利要求1所述的一种达氏鲟精子冷冻保存液在达氏鲟精子冷冻保存中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其应用过程具体如下：

1）、精液采集与检测

待达氏鲟繁殖季节，对雄性亲鱼进行B超检查性腺发育状况，对达到性成熟的亲鱼进行人工催产，采集精液时，用干毛巾擦净亲鱼生殖孔周围，挤压腹部，收集无粪便和杂物的干净精液于塑料袋中，充氧后密封并于4℃存放；

利用显微镜检测精子活力，成活率在90%以上的精液用于冷冻保存；

2）、精液的稀释、分装和冷冻

取100ml精液，加入100ml新鲜配制的冷冻保存液，稀释比为1:1；精液与冷冻液混匀后，立刻分装至2ml冷冻管中；

同时程序降温仪开启，预冷至0℃；

程序降温：从0℃开始，3℃/min降至-5℃，5℃/min降至-15℃；10℃/min降至-25℃；20℃/min降至-80℃，在-80℃平衡5min后，直接将冷冻管从程序降温仪中取出，立即放入液氮中保存；

3）、解冻和精子活力检测

将装有精子的冷冻管从液氮中取出，立即浸入40℃水浴中，一边摇动一边解冻，至完全融化为止；

在载波片上滴加30μl蒸馏水，然后用针尖蘸取少许精液，迅速涂在蒸馏水中，并利用显微镜观察精子激活后的运动状况，精子活力达70%以上，运动时间持续3-4min；

4）、解冻后精子用于授精

将采集的成熟卵置于洁净、干燥的容器中，再将解冻后的精液加入卵中，精子与卵子的比值约为3×10⁵，用手轻轻搅动，使精卵充分混匀，然后加水，激活精子使其与卵子受精，轻轻搅拌后，倒掉上方的污水，将卵移入孵化器中孵化。