[发明专利]表达牛虻抗血栓酶kfpase的毕赤酵母及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域中的一种毕赤酵母基因工程菌株及其应用。

背景技术

血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康，是导致死亡率最高的病因之一。在过去的几十年中，已经开发了针对血液凝固、血小板激活和聚集、血栓溶解的不同步骤而起作用的基础和临床药物，但是很多抗血栓药物经常被包括低血压、出血等系统性的副作用所限制，因此，需要开发新型的更具潜力和特异性的抗血栓药物。

牛虻抗血栓酶kfpase为一种单链蛋白，其表观分子量为27kDa。实验表明牛虻抗血栓酶kfpase具有明显的抗静脉血栓的作用。该工作对有潜力开发成为新型单组份抗血栓药物的牛虻抗血栓酶kfpase进行了较为系统的理化性质研究，为该酶的进一步开发和研究奠定了基础。

毕赤酵母表达系统具有表达量高、能进行蛋白质翻译后修饰、容易大规模生产、生产成本低、外源蛋白基因遗传稳定性较好等特点，目前国内外已有数百种外源蛋白基因在毕赤酵母中表达。毕赤酵母基因表达系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点：（1）具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机制最严格的启动子之一；（2）表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；（3）菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。

毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。

目前国内外尚未见到利用毕赤酵母表达牛虻抗血栓酶kfpase的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种毕赤酵母重组菌，该重组菌能生产牛虻抗血栓酶kfpase。

本发明所提供的毕赤酵母重组菌，是将牛虻抗血栓酶kfpase基因导入毕赤酵母得到的。

其中，所述牛虻抗血栓酶kfpase的氨基酸序列如序列列表中的序列2所示。

所述牛虻抗血栓酶kfpase基因的核苷酸序列是根据毕赤酵母菌的密码子偏好性，优化牛虻抗血栓酶kfpase基因核苷酸序列得到的，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

所述牛虻抗血栓酶kfpase基因是通过重组表达载体pPICZα-kfpase导入所述毕赤酵母中的，其中所述pPICZα-kfpase是将牛虻抗血栓酶kfpase基因插入pPICZαA的多克隆位点得到的。

所述毕赤酵母具体为毕赤酵母GS115。

本发明提供了一种生产牛虻抗血栓酶kfpase的方法。

本发明所提供的生产牛虻抗血栓酶kfpase的方法，是通过摇瓶培养发酵上述毕赤酵母菌得到牛虻抗血栓酶kfpase。

其中，所述发酵的温度为28-30℃；所述发酵液中发酵液的pH可为5.0-5.5。

所述的发酵过程中，从开始诱导起算，每24h，添加甲醇至终浓度为1%。

本发明所提供的毕赤酵母重组菌能高效表达牛虻抗血栓酶kfpase，表达的牛虻抗血栓酶kfpase具有较高的抑制血小板聚集能力，达到40%。

附图说明

图1为表达载体pPICZα-kfpase的结构图。

图2为诱导表达并纯化后，牛虻抗血栓酶kfpase的SDS-PAGE图。

具体实施例

实施例1毕赤酵母重组菌GS115-kfpase的制备。

线性化载体pPICZα-kfpase由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，溶于10ul灭菌水中，加入80ul毕赤酵母GS115感受态细胞，混匀，置于0.2cm电击杯中，冰浴5min，在2000伏电压（25uF）条件下电击，迅速加入1ml1mol/L山梨醇，置于28℃静置培养2h。然后将培养物涂布于含抗生素Zeocin（100ug/ml）的YPDS平板上，28℃培养3-4d，直至长出清晰的菌落。

挑取阳性重组子，将其直接接种于含30mlBMGY培养基的250ml摇瓶中，在28℃、250-300rpm的条件下培养至OD₆₀₀为2.0-6.0，然后室温下离心收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使其OD600为1.0，再用终浓度为1.0%的甲醇为唯一碳源进行诱导培养，每24h添加一次甲醇，培养48h，通过SDS-PAGE及体外活性检测筛选表达量高及活性较高的重组菌株。

实施例2利用毕赤酵母GS115-kfpase生产牛虻抗血栓酶kfpase。