[发明专利]无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法

说明书

技术领域

本发明涉及两性物质的高效分离技术，具体涉及一种无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法。

背景技术

IEF是20世纪60年代中期问世的一种利用pH梯度介质分离PI不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01个pH单位，特别适合于分离分子量相近而pI不同的蛋白质组分。IEF需要在一定抗对流介质(如凝胶)中加入特殊两性电解质，同时在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或乙酸等，在负极端引入碱液，如NaOH溶液、氨水等。当外加电场时，电解质和两性样品开始移动，混合物中pH最低的两性电解质分子，带负电荷最多，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。这类方法必需使用两性电解质，因为两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内的pH保持在其等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质，也移向正极，定位于第一种两性电解质之后。这样，经过一定时间后，具有不同pI的两性电解质按各自的pI依次排列，形成了从正极到负极pH值逐步上升的梯度，两性样品也被富集在与其pI相等的区域，从而按照pI分离。这一技术的分辨率高，且有浓缩效应，用于许多蛋白质样品的纯度分析或分离纯化。但不能进行样品的在线收集，需要将含有样品的凝胶带切割后再洗脱，操作繁琐，耗时长，而且两性电解质价格较贵，因此该法没有得到广泛应用，目前主要用于分离pI接近且价值较高的蛋白质样品。通过对现有文献的检索发现，中国发明专利CN103235026A公开了一种蛋白质等电聚焦电泳的方法及其装置；是关于蛋白质、核酸等大分子样品的等电聚焦装置和方法，该方法需要两性电解质构建pH变化的区带，从而实现等电聚焦；样品最终聚焦在抗对流介质中，同样不能实现样品的在线收集。

开发高效、稳定、自动化、样品覆盖范围广的制备型分离技术，是生物医药产品低成本、高效产业化之关键。越来越多的活性小分子极性物质被发现，例如，活性小肽、寡糖、小分子核苷酸、有机酸。然而，这些物质的制备分离存在技术难点，这些物质因不能在反相色谱柱上有效保留而不能被常规液相色谱分离纯化[Strege MA.Hydrophilic interaction chromatography-electrospray mass spectrometry analysis of polar compounds for natural product drug discovery[J].Anal Chem1998，70(13)：2439-2445.]；[Jiang Z，Smith NW，Ferguson PD，et al.Hydrophilic interaction chromatography using methacrylate-based monolithic capillary column for the separation of polar analytes[J].Anal Chem2007，79：1243-1250.]；[Strege MA，Stevenson S，Lawrence SM.Mixed-mode anion-cat ion exchange/hydrophilic interaction liquid chromatography-electrospray mass spectrometry as an alternative to reversed phase for smal l molecule drug discovery[J].Anal Chem2000，72：4629-4633]。虽然离子交换色谱可以满足离子型化合物的分离，但不能同时分离非极性化合物，高盐洗脱液还增加除盐负担[JonesIL，Carta G.Ion exchange of amino acids and dipeptides on cation resins with varying degree of crosslinking.1.Equilibrium[J].Ind Eng Chem Res1993，32：107-117]。

通常，非常复杂的样品，尤其是生物样品在分析之前必须经过分离和浓缩。IEF可以同时实现样品的分离和浓缩，是非常有效的分离手段，目前主要用于蛋白质的分离中。然而，已有的成熟的IEF必需引入两性电解质制作pH梯度，从而混在被分离的样品收集管中，对分析造成基质干扰效应。IEF技术通常用于蛋白质、多肽样品的分离制备，然而，很多极性小分子药物，例如，头孢菌素类抗生素也具有两性的特点，如果将IEF用于相关新药开发领域，具有重要意义。

发明内容