[发明专利]一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法

权利要求书

1.一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，其特征在于，步骤如下：

(1)挑取转染具有卡那抗性重组质粒或具有卡那抗性质粒的待转化的农杆菌单菌落接种于含卡那霉素(Kan)和利福平的YEP液体培养基中，培养至对数生长期，经固液分离，收集菌体沉淀，经液体MS基本培养基重悬，制得待转化菌液；

(2)切取花生幼苗的下胚轴，浸入步骤(1)制得的待转化菌液中进行转化，然后移至B培养基中，黑暗条件下共培养2～3天，经质量浓度为1％的头孢水溶液浸泡后，无菌水冲洗、晾干，制得转化后下胚轴；

所述的B培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入0.6～0.8mg NAA和7.5～8.5mg6-BA；

(3)将步骤(2)制得的转化后下胚轴移至C培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得初步筛选植株芽；

所述的C培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入0.6～0.8mg NAA、7.5～8.5mg6-BA、200～250mg Cef和50～75mg Kan；

(4)将步骤(3)挑取的初步筛选植株芽移至D培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得中度筛选植株芽；

所述的D培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入2.0～3.0mg GA3、2.0-3.0mg6-BA、200～250mg Cef和90～100mg Kan；

(5)将步骤(4)制得的伸长植株芽移至E培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得深度筛选植株芽；

所述的E培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入2.0～3.0mg GA3、2.0～3.0mg6-BA、200～250mg Cef和110～120mg Kan；

(6)将步骤(5)制得的深度筛选植株芽移至F培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，制得转化植株；

所述的F培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入IBA0.6～0.7mg、NAA0.1～0.2mg、GA3 1.0～1.5mg、肌醇80～100mg、VB₁1.0～1.2mg，pH5.8。

2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的MS基本培养基组分如下：

NH₄NO₃，1.65g/L；KNO₃，1.9g/L；CaCl₂·2H₂O，0.44g/L；MgSO₄·7H₂O，0.37g/L；KH₂PO₄，0.17g/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；FeSO₄·7H₂O，27.8mg/L；肌醇，100mg/L；甘氨酸，2mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；烟酸，0.5mg/L；蔗糖，30g/L；琼脂，7.2g/L。

3.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)的含卡那霉素和利福平的YEP液体培养基为在YEP液体培养基的基础上每升加入如下组分：

卡那霉素50mg，利福平50mg。

所述的YEP液体培养基每升组分如下：蛋白胨，10g；酵母提取物，10g；NaCl，5g，NaOH调节pH至7.2，高压灭菌20min。

4.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养，步骤如下：

在27～28℃、180～220rpm振荡培养40～50h，然后转至新的含Kan50mg/L和利福平50mg/L的YEP培养基中，27～28℃、180～220rpm振荡培养2～3h。