[发明专利]一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及土壤溶液中化合物的气质联用分析技术领域，更具体地说，涉及一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法。

背景技术

群体感应(Quorum sensing，QS)是指微生物自发产生、释放一些特定的信号分子，并能感知其浓度变化，从而调节微生物的群体行为。随着微生物学的深入发展，QS现象渐渐被大家所熟知。许多微生物的生理特性和活动都与群体感应息息相关。由于小分子在细菌胞间传递信息，在某种意义上使得细菌间能相互交流。革兰氏阴性细菌的群体感应一般都是由LuxI/R型信息系统调控，并以酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactones，HSLs)作为信号分子。HSLs是一类特殊的小分子水溶性化合物，能够很容易通过细胞膜。研究表明，许多革兰氏阴性菌都靠分泌HSLs进行交流和协调群体行为，如生物体发光、蛋白酶活性、抗生素的产生等等。

目前，对HSLs信号分子检测方法主要有酶联免疫、生物传感器、薄层层析和色谱方法。色谱方法包括气相色谱-质谱(gas chromatography-mass，GC-MS)、超级液相色谱(UPLC)、傅立叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)等。其中，生物传感器和薄层层析是分析HSLs化合物最常用的方法。生物传感器检测精度能够达到飞摩尔级，但是每种HSLs都需要特定的菌株和质粒，并且完成测定需要一天的时间。薄层层析的精度不高，只能用来测定较高浓度的HSLs。酶联免疫法简单、方便、快捷，但不能确定HSLs结构。超级液相色谱可以同时定量分析含羟基、羰基的多种HSLs，傅立叶变换离子回旋共振质谱是一种新兴的鉴定HSLs结构的方法，精度高。但由于这两种方法使用仪器比较昂贵，还无法普及到普通的实验室。GC-MS方法能够同时定性、定量地检测HSLs。但目前常规使用的GC-MS检测HSLs的方法还不够优化，且主要是针对纯溶液体系，对于复杂介质(比如土壤、沉积物)中的HSLs测定还不能提供准确的检测方法。

发明内容

1.发明要解决的技术问题

本发明提供了一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，克服了现有HSLs信号分子检测技术所存在的检测精度低、检测成本高、耗时以及不能很好地应用于复杂介质(比如土壤)中的HSLs测定等问题。

2.技术方案

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，其步骤为：

步骤一、将HSLs标准品用乙酸乙酯溶解并配制成1000mgL^-1的标准储备液，于-20℃下保存备用，所述的HSLs标准品为C₄-HSL、C₆-HSL、C₇-HSL、C₈-HSL、C₁₀-HSL、C₁₂-HSL和C₁₄-HSL；

步骤二、取土壤分别以土水比1:2、1:5、1:10的比例加入离心管中，震荡制备土壤溶液，离心分离，取上清液，向上清液中加入混标样品涡旋混匀，所述的混标样品为由步骤一制得的C₄-HSL、C₆-HSL、C₇-HSL、C₈-HSL、C₁₀-HSL、C₁₂-HSL和C₁₄-HSL标准储备液稀释混合配制而成；

步骤三、将乙酸乙酯加入步骤二制得的含HSLs的溶液体系中，漩涡萃取、离心分离，取乙酸乙酯相于含有无水Na₂SO₄的离心管中，漩涡混匀、离心分离，吸取有机相于进样瓶中；

步骤四、对步骤三得到的有机相中所含HSLs进行GC-MS检测，优化的色谱条件包括：进样口温度290℃，初始色谱柱温度设为100℃，以35℃min-¹升至150℃，紧接着以25℃min^-1升至280℃，保持6分钟，后运行温度为290℃，保持2分钟。

更进一步地，步骤四进行GC-MS检测时，采用分流进样模式，分流比为5:1。

更进一步地，步骤二所述的震荡制备土壤溶液，震荡速率为160rpm，震荡时间为8h，然后以4000rpm的速率离心5min，取上清液。