[发明专利]捕食线虫性真菌生物冻干制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体涉及一种捕食线虫的真菌、由该真菌获得的制剂。

背景技术

动物寄生虫病是家畜的一大类严重疾病，给畜牧业造成严重危害。长期以来，对家畜寄生性线虫的防治主要依靠化学药物，并发挥了巨大的作用。但是随着化学驱虫药产生的抗药性、药物残留及环境污染等问题日益严重，已经引起人们的广泛认识，因此利用捕食线虫性真菌对线虫的生物拮抗作用来防治动物寄生线虫已备受关注。

捕食线虫性真菌是由孢子萌发生长出营养菌丝，然后形成捕食器官进而捕食线虫，并通过内寄生方式消解线虫和产生毒素毒杀线虫等方式获得生存的一类微生物。正是因为此类真菌的这个特点，所以在寄生性线虫防治方面，捕食线虫性真菌是一个国家极其重要的宝贵生物资源。因为捕食线虫性真菌在培养基中，菌种仍继续发育生长，这样就会不断消耗其自身营养，使得其捕食性能下降，而且在此过程中极易发生污染。所以目前在捕食线虫性真菌临床应用中所面临的重要问题是如何制备一种能应用于生产实际的捕食线虫性真菌生物制剂。

发明内容

针对本领域存在的问题，本发明的目的是提出一种捕食线虫性真菌冻干制剂的制备方法。

本发明的另一目的是提出含有捕食线虫性真菌菌株厚壁孢子的真菌生物冻干制剂。

实现本发明目的的技术方案为：

一种捕食线虫性真菌生物冻干制剂的制备方法，其特征在于，是将捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans CIM1菌株在大麦粒培养基上进行厚壁孢子的批量培养，然后用冻干保护剂洗脱并保护厚壁孢子，再分装灭菌、预冻、真空冷冻干燥后获得。

本发明提出的制备方法，可以制备含有任一种捕食线虫性真菌(Duddingtonia flagrans)菌株的冻干制剂。优选的，使用如下菌株：

一种捕食线虫性真菌(Duddingtonia flagrans)菌株，该菌株(菌株名称为CIM1)的保藏号为：CGMCC No.9201，保藏日期：2014年5月5日。

所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，电话：(010)64807355。

所述捕食线虫性真菌(Duddingtonia flagrans)系发明人从内蒙古土壤中分离筛选后经纯化得到的。该菌株(菌株名称为CIM1)具有如下特性：Duddingtonia flagrans菌株生长温度范围为在15～35℃间均能生长，其中以35℃环境下生长率最高。Duddingtonia flagrans菌丝呈放射状地向周围生长，纵横交错，清晰可见，主干较粗，分支较细；菌丝无色分隔。外观白色至灰粉红色，生长后期有缠绕圈的形成，并可发现少数厚壁孢子着生于菌丝细胞之间。参见图1。

其中，所述大麦粒培养基的制备方法为：将大麦粒清洗干净，置干燥箱中烘干，按照大麦粒质量和蒸馏水体积1:1的比例加入蒸馏水，并将装有蒸馏水和大麦粒的容器于120～125℃灭菌20min后即得。所述的大麦粒是完整的大麦粒，或破碎的、部分破碎的大麦粒均可。

所述的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子批量培养可采用本领域公知的手段进行培养。优选的，Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子批量培养的条件为20～30℃，每天摇动1-3次，培养20～25天。

批量培养过程中，用手摇动即可，以防培养基板结。

其中，所述冻干保护剂由体积份的蒸馏水1000份和吐温-802份组成。

其中，所述预冻是在-80℃下预冻2小时。

所述真空冷冻干燥可采用常规的冷冻干燥方法进行。优选的，所述真空冷冻干燥的条件为：压强130×10^-3mbar～135×10^-3mbar，在-48℃至-55℃下，冻干18-25h。优选冻干20h。

本发明所述的制备方法制备得到的捕食线虫性真菌生物冻干制剂。

本发明的有益效果在于：

本发明提出的捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans菌株的菌丝受线虫幼虫蠕动刺激后，形成捕食器，对幼虫进行捕捉，随后菌丝侵入虫体内部，开始对线虫进行消解和吸收，最后导致线虫死亡。