[发明专利]一种等离子纳米金二聚体用于细胞内基因表达调控的方法

权利要求书

1.一种等离子纳米金二聚体用于细胞内基因表达调控的方法，其特征在于步骤如下：

（1）金纳米粒子修饰穿膜肽：将柠檬酸还原法合成的金纳米粒子与巯基聚乙二醇PEG 5000、穿膜肽TAT和DNA1混匀，24h后得到表面修饰有穿膜肽的Au-TAT-DNA1复合体；

（2）金纳米粒子与调控序列的偶联：将金纳米粒子与survivin基因的反义核苷酸anti-DNA和DNA2偶联，得到表面修饰有调控序列的Au-anti-DNA-DNA2复合体；

（3）双功能纳米金二聚体组装：将步骤（1）得到的Au-TAT-DNA1复合体和步骤（2）得到的Au-anti-DNA-DNA2复合体混匀，得到双功能纳米金二聚体组装结构；

（4）纳米金二聚体对细胞内基因的调控：将步骤（3）中得到的双功能纳米金二聚体组装结构与细胞共同孵育3h后，用胰蛋白酶消化细胞，得到纳米金二聚体调控后的细胞悬液；

（5）细胞内基因调控的表征：将步骤（4）获得的细胞悬液中的总RNA提取出来，再将其反转录为cDNA，用荧光定量PCR检测survivin基因在体内的表达量，并与内参基因β-actin相比较，计算其相对表达量，相对表达量=survivin基因表达量/β-actin基因表达量。

2.根据权利要求1所述等离子纳米金二聚体用于细胞内基因表达调控的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）金纳米粒子修饰穿膜肽：取100mL、2nmol/L、20nm的金纳米粒子以8000rpm的速度离心10min，并重悬在10mL 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS中得金溶胶；按金纳米粒子︰PEG︰TAT︰DNA1为1︰1000︰100︰5的摩尔浓度比同时向5mL金溶胶中加入PEG、TAT、DNA1；室温震荡24h后，8000rpm离心10min，去除上清液，沉淀重悬于纯水中，反复离心重悬3次，得到Au-TAT-DNA1复合体；

（2）金纳米粒子与调控序列的偶联：另取5mL上述金溶胶，并按金纳米粒子︰anti-DNA︰DNA2为1︰100︰5摩尔浓度比，向5mL金溶胶中加入anti-DNA和DNA2；室温震荡12h后，向溶液中加入NaCl至终浓度为80mM，继续震荡24h后，离心重悬于纯水中，得到Au-anti-DNA-DNA2复合体；

（3）双功能纳米金二聚体组装：将步骤（1）和（2）得到的Au-TAT-DNA1和Au-anti-DNA-DNA2复合体，按体积比1︰1混匀，60℃孵育20min后立即冷却至4℃，静置24h后，即得到双功能纳米金二聚体；

（4）纳米金二聚体对细胞内基因的调控：将步骤（3）得到的纳米金二聚体8000rpm离心10min，沉淀重悬于细胞培养液中，使纳米金二聚体的终浓度为5nM；将细胞接种于24孔培养板中，使每孔中的细胞数量为10⁴个，培养24h后去掉培养液，取7个孔分别加入上述含有纳米金二聚体的细胞培养液各300μL；每个孔分别转染0h、1h、2h、3h、4h、5h、10h后，去除培养液，用PBS反复洗涤各个孔中细胞5次，再向细胞中加入不含纳米金二聚体的新鲜培养液，继续培养48h后，收集细胞，得到不同转染时间处理的细胞悬液；

（5）细胞内基因调控的表征：用RNA提取试剂盒提取出步骤（4）各个细胞悬液中的总RNA，然后用反转录试剂盒分别把提取出的总RNA反转录成cDNA；以此作为模板DNA用荧光定量PCR法测定不同转染时间后细胞内survivin基因的表达量，同时与细胞内的内参基因β-actin进行比较，计算出其相对的表达量；相对表达量=survivin基因表达量/β-actin基因表达量；

（6）电镜表征：采用生物透射电镜对步骤（4）得到的细胞悬液进行表征。

3.根据权利要求1所述等离子纳米金二聚体用于细胞内基因表达调控的方法，其特征在于：所述DNA1序列如SEQ ID NO.1所示，DNA2序列如SEQ ID NO.2所示，Anti-DNA序列如SEQ ID NO.3所示，TAT多肽序列如SEQ ID NO.4所示。