[发明专利]一种检测α-1,3Gal抗原的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种检测α-1,3Gal抗原的试剂盒及其应用。

背景技术

由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被广泛用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等。异种器官也早已成为解决器官移植中供器官严重缺乏的潜在途径之一。然而，动物源性生物材料或异种器官组织应用于人体所带来的免疫学问题直接影响着这类材料使用的安全性和有效性。异种器官移植的最大障碍是供器官异种抗原与受者体内天然抗体结合后激活补体系统，攻击供器官而产生的超急性免疫排斥反应(Hyperacute rejection，HAR)，其发生时间在异种移植后的几分钟至数小时，供器官在短时间内发生功能衰竭使移植失败。动物源性生物材料虽经各种去除抗原的处理，却难以彻底去除所有的异种抗原，残留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反应和免疫毒性而影响损伤愈合的重要因素。

已有研究显示异种抗原α-半乳糖基抗原(α-1,3-galactosyle，α-Gal)是动物源性生物材料或异种器官移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。α-Gal是含有聚乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于猪和其它低等动物体内。由于人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗α-Gal抗体(占总血清球蛋白的1％)，因此当人体接受含有Gal抗原的生物材料或异种器官移植时会导致超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应。动物源性生物材料或异种器官移植中Gal抗原的去除成为降低免疫排斥和慢性免疫毒性反应的关键。目前，如何评价Gal抗原的去除和残留Gal抗原诱导的免疫毒性尚存在着瓶颈。由于野生型低等动物都表达α-Gal抗原，因此无法利用野生型低等动物去评价α-Gal抗原相关的免疫毒性反应，只能用狒狒作为受体来考察α-Gal抗原阳性或者异体器官的免疫毒性反应，而这种动物稀少很难普及使用。因此，如何评价动物源性生物材料或异种器官组织的免疫毒性成为困惑检测与监管机构因没有方法和标准可依据而无法进行有效的安全性和质量监控，同时也限制了该类产品的研发和产业化发展。

为了填补检测α-Gal抗原试剂盒的空白，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出了一种检测α-1,3Gal抗原的试剂盒。

为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种检测α-1,3Gal抗原的试剂盒，所述的试剂盒中含有：固相α-1,3Gal抗原包被的孔板、封闭液、鼠M86抗体、二次抗体酶结合物、TMB显色液、显色终止液、组织裂解液、浓缩洗液、样品稀释液、阳性参考品和阴性参考品。

本发明的第一优选技术方案为：固相α-1,3Gal抗原包被的孔板预先采用α-Gal抗原进行包被，包被缓冲液为pH9.5、0.2M的碳酸盐缓冲液，包被量优选为50～100μl；抗原浓度为10～100ng/ml，优选为50～100ng/ml。

本发明的第二优选技术方案为：所述的封闭液为人血清白蛋白；所述的样品稀释液为PBS；所述的显色终止液为浓硫酸；所述的浓缩洗液为吐温-20；所述的二次抗体酶结合物为辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgM酶结合物。

本发明的第三优选技术方案为：所述的阳性参考品为动物组织的冻干品,即为猪肝脏组织的冻干粉；阴性参考品为人源组织的冻干品，即为人胎盘组织的冻干粉。所述的阳性参考品和阴性参考品的制备方法为首先将新鲜组织经0～4℃生理盐水漂洗后去除多余水分，再在0～4℃条件下进行匀浆；最后将匀浆组织进行冻干，分装保存在-20℃。

本发明还涉及该检测α-1,3Gal抗原的试剂盒的制备方法：配制50ng～200ng/ml的Gal1,3Gal-BSA溶液，缓冲液为0.2M、pH9.5碳酸盐缓冲液；取100μL Gal1,3Gal-BSA溶液加入到孔板，4℃孵育过夜；次日用1％的人血清白蛋白进行封闭，封闭的条件优选4℃、1～2小时，然后用0.05％的吐温-20/PBS洗液进行洗板三次，加洗液250μl/孔，浸泡30s，清洗三次；去除洗液后干燥，密封包装，4℃保存。

本发明还涉及该检测α-1,3Gal抗原的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)试验样品制备：将待测试验样品放进裂解液中进行低温匀浆；α-Gal抗原阳性参考品和α-Gal抗原阴性参考品各加入裂解液中进行组织裂解；离心，取上清液备用；