[发明专利]靶向OLFM4基因的干扰RNA、慢病毒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，主要涉及利用RNAi沉默OLFM4基因用于制备预防、治疗胃癌肿瘤向腹腔或/和肝转移的药物中的应用。 

背景技术

胃癌是我国第二大常见恶性肿瘤，亦是癌症致死的第二大原因。尽管目前胃癌综合治疗措施不断发展完善，使得当前的治疗仍不能获得满意效果，由于多数胃癌患者在首诊时已属中晚期，进展期胃癌占住院病例90％以上，术后5年生存率长期徘徊在30-50％。目前研究发现多数恶性肿瘤治疗效果不佳的主要原因在于转移与复发。胃癌晚期，恶性癌细胞经侵袭发生血行播散经门静脉转移至其他器官如肝脏，导致多种脏器功能衰竭，因此胃癌侵袭与肝转移是晚期胃癌患者死亡的最主要原因之一。由此，对于胃癌的抗转移治疗现状，寻找一个治疗性靶点抑制胃癌的浸润和肝转移，将有助于改善胃癌治疗，在提高晚期胃癌患者生存率具有重要意义。 

从医学角度而言，肿瘤细胞无限制增殖是良性与恶性肿瘤的共同特征；而肿瘤的恶性侵袭与转移则是区分良性肿瘤与恶性肿瘤的主要特征之一。恶性肿瘤最重要的生物学特点在于恶性肿瘤不仅可在原发部位浸润生长、累及组织；而且还可通过多种途径扩散转移到身体其他部位。尽管侵袭和转移均为恶性肿瘤的生长特性，但二者是不同病理过程，浸润是转移的前奏，但并不等于一定发生转移，然而转移必定包含侵袭的过程，它们共同构成恶性肿瘤的播散。许多治疗靶点对肿瘤细胞的增殖能力调控并不等同与其同时具有调控恶性侵袭与转移能力。目前发现，多种恶性肿瘤高表达蛋白如Cyclin D1，具有调控细胞周期与细胞增殖功能，但并不具有控制恶性侵袭与转移功能。 

OLFM4，又名GW112、hGC-1、hOlfD，是2002年新发现的一种由粒细胞集落刺激因子GM-CSF刺激产生的具有嗅觉介导素结构域(olfactomedin domain)蛋白家族成员分子。它最初被克隆于人的原始粒细胞，位于人类13号染色体13q14.3，编码510个氨基酸，其蛋白产物为olfactomedin4的前体，属于嗅觉介导素olfactomedin相关蛋白家族。此类蛋白多表达于神经系统，涉及神经系统的发育。 

OLFM4蛋白是一种分泌性糖蛋白，包括N-连接的碳水化合链和二硫化物多聚体，它与细胞表面的多种凝集素结合，如普通的凝集素1、刀豆蛋白凝集素A、麦胚凝集素。GW112蛋白的保守半胱氨酸对蛋白寡聚化或分泌非常重要，其中半胱氨酸83，85，246和437是蛋白二聚体形成所必需的，半胱氨酸226是多聚体形成的关键。OLFM4蛋白和钙粘蛋白的相互作用，依赖于OLFM4蛋白C端的嗅觉介导素区域。OLFM4蛋白可粘附在细胞表面，增强NIH3T3和293T/17细胞的扩散和粘附作用。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向OLFM4基因的干扰RNA在用于制备预防、诊断、治疗胃癌肿瘤向腹腔或/和肝转移的药物中的用途。 

本发明的目的是通过以下措施实现的： 

一种靶向OLFM4基因的干扰RNA，其核苷酸序列如下 

正义链： 

5′-CCGGAACGCTTGGAATTCACAGCTCGAGCTGTGAATTCCAAGCGTTTTTTTG-3′； 

反义链： 

5′-AATTCAAAAAAACGCTTGGAATTCACAGCTCGAGCTGTGAATTCCAAGCGTT-3′。 

体外合成所述述可转录出特异靶向OLFM4基因干扰性RNA(RNAi)的DNA序列，OLFM4基因RNAi靶点DNA序列为：AACGCTTGGAATTCACAGCTC。干扰RNA，下划线部分所示为OLFM4基因RNAi靶点DNA序列，构成转录后RNA的“Stem(茎)”结构部分；框中所示部分为6个碱基的loop环结构，具有连接转录后RNA的“茎”结构功能。 

本发明进一步提供了包含上述干扰性RNA的Lentivirus慢病毒，所述慢病毒载体的结构如图1所示。上述RNA干扰序列经退火体外合成为双链DNA，并通过两段酶切位点连接入RNAi干扰载体，转染或包装入病毒并感染细胞后，在细胞内能转录出特异抑制OLFM4基因信使RNA(mRNA)转录的RNAi片段，有效的降低OLFM4基因mRNA转录水平进而对OLFM4蛋白表达进行抑制。 

上述靶向OLFM4基因的RNAi慢病毒载体，制备方法包括以下步骤：