[发明专利]一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒及骨桥蛋白作为特异标记物的应用

说明书

技术领域

本发明涉及技术领域，特别是涉及一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒及骨桥蛋白作为特异标记物的应用。

背景技术

肺癌是目前发病率和死亡率均居第一位的恶性肿瘤。尽管近几年来肺癌的综合治疗取得很大进展，然而其5年生存率仍然徘徊在15％左右。肺癌的70％～80％为非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)，NSCLC很容易发生远处转移(脑、骨、肾上腺和肝脏转移)。即使I期肺癌患者，在术后也有27％-55％的患者将出现复发转移的情况。如何早期鉴别这部分高危人群并及时给予辅助治疗是目前研究的焦点。

目前，包括微小RNA、基因、染色体、和蛋白等用于预测预后或干预治疗的因素已被广泛研究，其主要研究对象局限于肿瘤细胞本身，忽略了肿瘤生存的“土壤”—微环境。肿瘤的微环境指肿瘤细胞周围的纤维原细胞、免疫细胞和细胞外基质等；微环境是肿瘤与宿主之间的相互作用的直接接触面，它在肿瘤细胞的发生演进过程中起重要作用。在肿瘤微环境免疫细胞中最重要的是巨噬细胞。浸润肿瘤间质中的巨噬细胞称之为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)。既往认为TAMs只是肿瘤免疫调节过程中的一种重要细胞群,可以直接杀伤肿瘤细胞,或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而清除肿瘤。

近年来,Mantovani等提出了著名的“巨噬细胞平衡假说”,认为TAMs具有杀伤肿瘤和促进肿瘤生长的双重作用。一部分TAMs表现出促进肿瘤进展的M2表型；相反另外一种表型为M1，具有抑制肿瘤的功能。NSCLC间质中的TAMs功能尚存争论，不同学者的研究结果甚至相互矛盾，目前并无确切的解释,其关键因素在于目前关于M2和M1巨噬细胞缺乏特异性的标记物。

申请人在研究肺癌标本癌巢骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)的表达时发现，不仅肿瘤细胞表达OPN，而且部分病例的肿瘤间质中浸润的TAMs也表达OPN。进一步分析显示伴有OPN阳性TAMs浸润的患者较OPN阴性TAMs浸润患者更容易出现远处转移，预后更差。这在既往有关NSCLC的研究中从未报道过。

目前市场上销售的唑来膦酸等治疗恶性肿瘤骨转移的药物其机理都是通过抑制骨组织的破骨细胞(巨噬细胞分化而成)达到治疗作用。大量的体内和体外实验证实唑来膦酸可抑制肿瘤细胞的增殖和转移，然而这种抑制并非“靶向”，同时包括了M1型和M2型的巨噬细胞，如果指导唑来膦酸的“靶向”抑制M1型将大大促进促进肿瘤治疗的发展。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种鉴别M2型TAMs的标记物，并用于构建预测NSCLC病人预后及指导唑来膦酸临床应用的试剂盒。

本发明的另外一个目的在于提供一种将骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)作为M2型巨噬细胞的特异性标记物的应用。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒，其特征在于包括CD68单克隆抗体、OPN单克隆抗体、荧光二抗和免疫荧光试剂。

所述荧光二抗为CD163标记M2鼠抗人单克隆抗体和MHCII标记M1鼠抗人单克隆抗体。

免疫荧光试剂包括pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS，全称Phosphate Buffered Saline)、0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液、3％的牛血清白蛋白和荧光淬灭抑制剂。

所述磷酸盐缓冲液是将8.00g的NaCl、0.20g的KCl、2.083g的Na₂HPO4·12H₂O、0.261g的KH₂PO4·12H₂O放入950ml的蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.2-7.4，然后蒸馏水定容至1000ml制备而成。

所述柠檬酸钠缓冲液是将3g的柠檬酸三钠、0.4g的柠檬酸加入1000ml的蒸馏水制备而成。

上述骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)可作为M2型巨噬细胞的特异性标记物的应用。

本发明的原理及有益效果是：本发明能够体现OPN阳性表达的TAMs是一预后预测标记物，可作为非小细胞肺癌移复发、预后预测提供新的试剂盒，通过本发明发现OPN阳性TAMs可作为唑来膦酸抗肿瘤治疗疗效的标记物；应用本发明试剂盒是采用免疫荧光双标技术检测组织芯片中OPN在TAMs和肿瘤细胞中的表达，对NSCLC病人预后进行评估，并针对试剂盒的检测结果及时采取综合手段干预，提高病人远期生存率，改善预后，方法简单、方便、可广泛应用于临床。