[发明专利]一种骨髓去分化间充质干细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种人骨髓去分化间充质干细胞的培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)

来源于发育早期的中胚层和外胚层，最初在骨髓中被Friendenstein等发现为非造血组织干细胞，由于其具有可分化为间充质组织细胞的能力，故称之为间充质干细胞。以后陆续在许多组织中分离到，包括脂肪、滑膜、软骨、骨膜、胎盘和脐血。间充质干细胞在合适的条件下可以分化成为内胚层、中胚层和外胚层细胞等,并且易于分离培养。以其独特的低免疫原性和多向分化和自我更新功能得到了普遍的认可，间充质干细胞并广泛的应用于组织工程和再生医学中。

1.间充质干细胞生物学特性

间充质干细胞具备以下共同属性：(1)，间充质干细胞是具有自我维持和自我更新的细胞群体，其细胞数目是相对恒定的，即间充质干细胞具有自稳定性。(2)，在生物体总的细胞构成比上，间充质干细胞只占有其中很小的一部分。(3)，间充质干细胞可在适宜环境中向不同方向分化，即其为相对未分化类细胞。

1.1MSCs具有强大的自我更新和多向分化能力。

MSCs可以分化为软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、基质细胞等多种细胞的能力。间充质干细胞可以经诱导向成骨细胞方向分化，也可以经诱导后向脂肪细胞方向分化，其双向分化特性在骨质疏松发生时的骨量减少和骨髓中的脂肪组织增多相伴行的现象中发挥重要作用。研究发现，间充质干细胞在经定向诱导成骨分化成熟后，通过改变诱导培养基的方法，将成骨诱导培养基转换成脂肪诱导培养基后，可见明显脂肪细胞形成。从已分化成熟的细胞形态转换成另一种细胞形态，是间充质干细胞转分化的特点。MSCs在适宜的外界刺激作用下可以分化成非中胚层细胞，包括功能性神经元，星形胶质细胞，内皮细胞等。将MSCs注射到囊胚层后，一部分细胞分化为多种组织和器官的体细胞，如大脑，肝脏，肾脏，肺，脾，血液和皮肤等。间充质干细胞在被诱导后仍然维持其多向分化潜能。

1.2MSCs具有独特的免疫原性。

MSCs通过与细胞的直接接触、旁分泌细胞因子抑制T细胞的增殖、自身免疫反应的微环境等多种途径负性调控免疫应答，发挥其免疫重建功能。一些文献报道MSCs可以分泌多种细胞因子，如肝细胞生长因子和转化生长因子，前列腺素，NO，以及通过细胞之间的直接接触作用参与了PD-1信号通路。Krampera等证明MSCs在与IFN—γ共培养的时候可以抑制B细胞的增殖。Zhang等研究发现在移植前或者移植后多次注射MSCs可下调免疫排斥反应。Schatton等证实MSCs可以延长移植物在体内存活时间。目前大量的文献报道显示MSCs可以在注射到动物体内后，发挥其低免疫原性作用而大大降低移植物引起的免疫排斥作用。

1.3MSCs来源广泛，易于体外分离，扩增和培养，多次培养传代后仍具有干细胞特性，在体外可较长时间保持相对未分化状态。

1.4MSCs间充质干细胞体外转染率高，并且异体移植排异较轻，配型要求不严格，能高效稳定表达多种治疗性外源目的基因。因此，间充质干细胞不仅是组织工程中的具有前景的种子细胞，还是理想的细胞增殖分化模型，被认为是在治疗学和生物技术方面有优质潜能的种子细胞，为器官、组织损伤后的再生修复和自身免疫性疾病治疗带来新的曙光。

2.间充质干细胞的成骨分化

理想的成骨种子细胞应该具备以下特点：(1)容易取材，对机体的伤害小。(2)在体外的定向培养中可以分化为成骨细胞，具有较强的增殖传代能力。(3)细胞移植入体内后能够适应机体的生理、病理和应力等环境的影响并能保持成骨的活性。而间充质干细胞作为组织工程中重要的种子细胞具备了上述成骨种子细胞的特点，成为骨组织工程研究中的具有潜力的优势种子细胞。