[发明专利]一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术和肥料技术领域，具体涉及一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法。 

背景技术

γ–PGA的全名是γ-Polyglutamic acid，是一种微生物发酵产生的细胞外阴离子型多聚氨基酸，由D-和L-谷氨酸通过α-氨基酸和γ-羧基酰胺键连接而高分子聚合物，γ-PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，相对分子质量一般在100KD～1000KD，呈直链纤维状，在γ-聚谷氨酸的分子链上具有大量的活性较高的游离羧基。除了其对人体无毒、生物可降解性和其降解产生对环境友好的终产物谷氨酸等优点外，还包括其具有高吸水性及保水性、良好的控制释放能力、螯合金属离子、与铁、钙、镁锌等形成同离子复合体以获得更佳的营养生物可用性，以及良好的抗植物病原活性，刺激作物及其种子生长以及保护其免受植物病原菌影响，整合植物营养、提供土壤中难溶养分有效性、调整土壤pH等独特功能，使γ-聚谷氨酸在农业上的应用具有较好前景。 

专利CN102268389，公开了一种甲基营养芽孢杆菌及其发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。该甲基营养芽孢杆菌培养时不需要谷氨酸，但产率过低，约17g/L。制得的发酵液经离心去除菌体，上清液加入2～4倍体积的无水乙醇、甲醇或丙酮沉淀聚谷氨酸，4℃静置过夜，用有机溶剂洗涤，去离子水透析除去盐，最后冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸。步骤复杂，其中还需使用大量化学溶剂洗涤沉淀，时间和成本都大大增加。专利申请号CN102703356A，公开了一种聚-γ-谷氨酸作为农用芽孢杆菌保护剂的应用，其中γ-聚谷氨酸也需要经过灭菌、纯化和真空干燥步骤，才能使用γ-聚谷氨酸，步骤复杂，使用操作繁琐，增加了处理的时间和成本，不利于工业生产。 

综上所述，节约γ-聚谷氨酸工业生产成本，大大提高发酵产率，以及对发酵液进行简单方便和稳定处理，对γ－聚谷氨酸在农业肥料方面应用具有重要意义。 

发明内容

为了克服以上所述之技术问题，本发明提供了一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法，使得γ－聚谷氨酸的生物发酵效率得以大大提高，以及解决传统发酵液处理步骤复杂，使用大量化学溶剂洗涤和沉淀的问题，大大节约工业应用的时间和成本， 有利于工业化生产以及环境保护。 

本发明的技术方案：为了实现上述目的，本发明一种来源于味精厂排口土壤中分离、选育的谷氨酸依赖型甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，已于2013年10月9日，经中国典型培养物保藏中心鉴定为甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)菌株BT1301；该菌株已保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2013462。 

本发明所述依赖谷氨酸发酵生产γ-聚谷氨酸的菌株甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BT1301，最初来源于味精厂排口土壤样本，样本经液体培养基富集培养和稀释涂布后，进行摇瓶发酵培养，最后对发酵液的γ-聚谷氨酸进行定性定量分析，最终得到生产γ-聚谷氨酸的菌株，并进行菌株的分离与鉴定。图1是BT1301在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上菌落显微照片,显微镜下细长杆状，0.5～0.75μm×1.5～2.5μm，不规则形状，有的细胞呈V形排列；图2是BT1301在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上菌落呈白色或灰色、不透明，圆形边缘整齐。 

申请人委托中国典型培养物保藏中心(CCTCC)经过序列测定，该甲基营养芽孢杆菌BT1301的16S rRNA核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。菌株BT130116S rRNA基因测序BLAST结果说明：与甲基营养芽孢杆菌具有较高的同源性，相似度为99.86％，鉴定该菌株为甲基营养芽孢杆菌。 

甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BT1301具有以下性质： 

1.形态特征 

在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上营养细胞为0.5～0.75μm×1.5～2.5μm大小的杆菌，当培养基中添加谷氨酸时，见图3，BT1301形成无色半透明隆起菌落，像半粒玻璃珠在平板上；菌落表面光滑边缘整齐、湿润粘稠。 

2.生理生化特征见表1和表2 

表1生理生化特性—碳源利用