[发明专利]脑炎病毒基因修饰系统的构建及其应用

权利要求书

1.脑炎病毒突变株，是将野生型脑炎病毒基因组RNA中编码E1蛋白的第253位氨基酸Phe的密码子替换为编码氨基酸Ser的密码子，且将编码PE2蛋白中RKRR四肽的核苷酸序列缺失后得到的重组病毒。

2.根据权利要求1所述的脑炎病毒突变株，其特征在于：所述野生型脑炎病毒为脑炎病毒XJ90260株。

3.根据权利要求1或2所述的脑炎病毒突变株，其特征在于：所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列2的第45-11477位。

4.制备权利要求1-3中任一所述脑炎病毒突变株的方法，包括如下步骤：

（a）将在野生型痘苗病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；

（b）用所述野生型痘苗病毒感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；

（c）将步骤（a）中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为核苷酸片段A，得到重组质粒乙；所述核苷酸片段A为含有权利要求1-3中任一所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段；

（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述核苷酸片段A替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；

（e）提取步骤（d）得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述脑炎病毒突变株。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述野生型痘苗病毒为野生型痘苗病毒WR株。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法的步骤（a）中，所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为NC_006998.1的序列的第80267-80725位和第80726-81194位；或

在所述核苷酸片段A中，在所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列前，含有T7启动子相关序列；

所述T7启动子相关序列具体为序列表中序列2的第10-44位；

所述核苷酸片段A的序列具体为序列表中序列2的第10-11534位。

7.蛋白质，为权利要求1-3中任一所述脑炎病毒突变株的基因组编码所得蛋白质。

8.编码权利要求7所述蛋白质的核酸分子；

所述核酸分子具体为如下1）-3）中任一DNA分子：

1）序列表中序列2的第89-11357位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2的第10-11534位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表中序列2所示的DNA分子。

9.权利要求1-8中任一所述脑炎病毒突变株或所述蛋白质或所述核酸分子在制备抗病毒疫苗中的应用；

所述抗病毒疫苗具体为抗脑炎病毒疫苗。

10.如下（b1）-（b3）任一中的生物材料：

（b1）含有权利要求1-8中任一所述脑炎病毒突变株或所述蛋白质或所述核酸分子的离体动物细胞或重组菌；

（b2）含有权利要求1-6中任一所述脑炎病毒突变株的基因组RNA或cDNA的载体；

（b3）活性成分为权利要求1-8中任一所述脑炎病毒突变株或所述蛋白质或所述核酸分子的抗病毒疫苗。