[发明专利]一种用于弓形虫感染预防的疫苗和制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫学和分子生物学领域，具体地，涉及一种用于弓形虫感染预防的疫苗。

背景技术

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T.gondii）是一种专性细胞内寄生原虫，可引起人兽共患弓形虫病。弓形虫可感染包括人类在内的几乎所有的哺乳类动物，猫科动物是其主要传染源。全世界约有1/3的成年人感染，我国人群的感染率为5%～20%，家畜动物感染率为10%～50%。作为一种机会致病因子，弓形虫在正常宿主的机体中多呈隐性感染，无明显临床症状；但对于器官移植、艾滋病、恶性肿瘤患者等免疫缺陷或免疫抑制者，弓形虫可能是致死因子之一；孕妇感染弓形虫可导致流产、死胎以及胎婴先天性缺陷、发育畸形、脑炎及脑膜炎等。弓形虫感染可引起家畜发生高热流产，并能和其他病原微生物协同作用，给全世界的畜牧业造成巨大的经济损失。使用安全有效的疫苗接种被认为可能是预防弓形虫病的最佳预防措施。

常用于弓形虫疫苗研究的候选抗原主要有微线体蛋白（microneme protein）、棒状体蛋白（rhoptry proteins，ROPs）、膜表面抗原（surface antige,SAG）及致密颗粒蛋白（dense granule protein）。其中，微线体是顶复门（Phylum Apicomplexa）原虫的一种细胞器，也是弓形虫重要的具有分泌功能的细胞器，在虫体入侵宿主细胞阶段发挥重要作用。ROPs是速殖子顶端棒状体分泌的对弓形虫侵入宿主细胞起重要作用的蛋白质，在虫体入侵、纳虫空泡（parasitophorous vacuole，PV）的形成和修饰过程中起着重要作用，它是重要的入侵和毒力作用因子。弓形虫膜表面蛋白1（major surface protein1，SAG1）也是研究最多的疫苗候选分子之一。因此研究与弓形虫入侵及相关毒力因子的疫苗候选抗原，对于抗弓形虫疫苗的研究，以及弓形虫病的预防和控制具有重大意义。

弓形虫疫苗的研究经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、基因工程疫苗以及DNA疫苗，DNA疫苗又包括单基因疫苗和复合基因疫苗。目前，研究较多的是复合多价疫苗和核酸疫苗。各种疫苗均有其优缺点。灭活疫苗的安全性较好，但其抗感染的能力弱；弱毒疫苗有着较好的保护性，但在安全性上一直存在着毒力返强及弓形虫感染中间宿主后在体内形成组织包囊等问题；基因工程疫苗生产过程复杂、技术难度大、且生产成本较高，其保护力及安全性还有待进一步改进；核酸疫苗具有无需使用佐剂、无需表达和纯化重组抗原、且能产生CTL作用、免疫具有持续性及可制成多价疫苗等优点而得到了广泛的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于弓形虫感染预防的疫苗。为此，本发明还提供所述疫苗的制备方法及其应用。

棒状体蛋白38（ROP38），是一种在不同虫株间存在不同表达的活性酶，分布于棒状体内，与弓形虫PVM的形成有关，而且是继ROP16和GRA15之后，第三个被发现的能改变宿主信号转导的蛋白，因此，弓形虫ROP38有望成为理想的疫苗候选抗原。

本发明提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列：1）序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；

2）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

3）对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰，并具有弓形虫感染预防功能的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种重组蛋白，其氨基酸序列由权利要求1所述的核苷酸序列编码。

优选地，所述氨基酸序列参见序列表中SEQ ID No.2。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列。

本发明的第四个目的是提供一种重组质粒，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明的第五个目的是提供一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。

本发明的第六个目的是提供上述的核苷酸序列、重组蛋白、重组载体、重组质粒、疫苗在弓形虫感染预防中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种上述疫苗的制备方法，步骤如下：

（1）提取弓形虫RH株总RNA；

（2）RT-PCR扩增RH株总RNA；

（3）将步骤2中的扩增产物与载体连接；

（4）pVAX I质粒的小量提取；

（5）回收pVAX I载体及目的片段ROP38；

（6）连接pVAX I载体与目的片段ROP38；