[发明专利]CRISPR‑Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法。 

背景技术

乙型肝炎病毒（Hepatitis B VIRUS, HBV）属于嗜肝DNA病毒科，是引发病毒性乙型肝炎的病原体。全球约1/3的人曾感染过HBV，慢性HBV感染者约有3-4亿人，其中25%-40%人死于HBV感染相关疾病，HBV是全球第九大致死性疾病。 我国属于HBV感染的高流行区，一般人群的乙肝病毒感染标志，乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性率接近10%。对现有病毒性乙型肝炎患者及HBsAg携带者的防治工作，在今后几十年里仍会是一项艰巨的任务。 

乙型肝炎病毒又是一种逆转录病毒，其基因组是由两条螺旋的DNA链围成的一个环状结构，大小约为3.2KB，是一个相当小的病毒。其基因组共有四个开放阅读框（open reading frame, ORF），编码以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L，M，S）。两条螺旋的DNA链，其中一条较长负链已经形成完整的环状，另一条长度较短的正链，呈半环状。一旦感染肝细胞，病毒DNA就会入核，在核里，这条半环状的DNA链要以负链为模板，在乙肝病毒DNA聚合酶的作用下延伸，最终形成完整的环状。乙肝病毒基因组也就形成了一个完整的环状双链DNA，即共价闭合环状DNA（Covalently closed circular DNA，cccDNA）。cccDNA可以看做是病毒复制的原始模板，既能转录产生3.5KB的前基因组mRNA，又能转录出病毒mRNA并翻译产生包括HBsAg在内的四种病毒蛋白。病毒基因以其中的一条cccDNA为模板转录形成前基因组mRNA之后，前基因组DNA逆转录形成负链DNA，复制出正链，最后再装配到一起形成新的双链乙型肝炎病毒DNA，其中一部分双链DNA会在核里重新形成cccDNA。每个细胞核中大约15-20个拷贝的cccDNA可能会在易错的病毒复制多聚酶的作用下发生病毒的变异，造成抗药性。 

目前，治疗乙型肝炎的药物主要包括核苷酸类似物和干扰素等，其中以核苷酸类似物临床应用最广泛。核苷酸类似物可以阻断病毒RNA和新的病毒DNA的产生，但是对于已经存在的病毒cccDNA却没有作用。随着HBV耐药突变株的不断出现，使得现有的抗HBV药物难以达到理想的治疗效果。此外，HBV cccDNA还可能是病毒产生抗药性的关键原因，因此，即使是部分失活HBV cccDNA都具有重要的治疗价值，这样，特异性靶向HBV cccDNA引起了人们的广泛关注。 

2010年，Engineered zinc finger nucleases (ZFNs) 被成功的应用于HBV cccDNA的敲除，效率大约为26%。2013年，Engineered transcription activator-like effectors (TALEs) 也被用于突变HBV cccDNA，效率大约为35%，相应地，HBsAg降低了大约20%。很明显，现有的技术还很难满足需要，人们期待找到更高效的HBV cccDNA的敲除策略。