[发明专利]狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株

说明书

技术领域

本发明主要涉及一种新的狂犬病病毒株，具体涉及一种狂犬病病毒鸡胚细胞适应株。

背景技术

狂犬病病毒（Rabies virus，RV）是高度嗜神经病毒，为弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus genus）中不分节段的单股负链RNA病毒，能引起人兽共患的世界性传染病—狂犬病。据报道全世界每年因狂犬病的死亡人数约有5.5万例,实际死亡人数应明显高于该统计数字（http://www.worldrabiesday.org/）。目前除日本、英国、夏威夷等少数国家和地区没有狂犬病发生以外,该病呈世界性流行，其中亚洲和非洲是人狂犬病发生最严重的地区,占全世界死亡总人数的99%。在正式报告狂犬病的国家中,印度每年有3万人以上死于狂犬病,居首位；我国近20年每年统计到的死亡人数超过3000例,居第二位(Yunpeng wang et al.,2012.Journal of Applied Virology.1:10-19)。目前狗仍然是人狂犬病的最重要的宿主。

RV基因组大小约12kb，由3′端至5′端依次排列着5个RV结构蛋白基因，分别编码五种已知的结构蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和依赖RNA的RNA多聚酶（L）。N蛋白在RV复制过程中与RNA结合成核糖核酸蛋白（RNP）；L蛋白和磷蛋白与RNP紧密相连呈螺旋状结构，确保基因组在细胞质中转录和复制；M蛋白是一种连接蛋白，为RV5种结构蛋白中变异较大的蛋白质之一，其占据了核衣壳和外壳之间的位置，并将两者连接一起；G蛋白是RV中唯一暴露在病毒粒子表面和诱导宿主产生中和抗体的蛋白，其羧基端插入RNP中，负责与宿主细胞表面的受体的结合。

G蛋白由G基因编码，共有1675个核苷酸，编码524个氨基酸。G蛋白是RV的主要保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体，保护机体抵抗RV的感染(Wiktor et al.，1973.J.Immunol.110:269-276；Cox et al.，1977.Infect.Immun.16:754-759；Perrin et al.，1985.Vaccine.3:325-332)。当前无论人用还是兽用狂犬病疫苗,其效价主要取决于疫苗制剂中G蛋白的含量。G蛋白上至少存在3个中和抗体结合位点：抗原位点Ⅲ（antigenⅢ，GⅢ）、抗原位点Ⅱ（antigenⅡ，GⅡ）及次要抗原位点Ⅰ（antigenⅠ，GⅠ），其中GⅡ位于34-200氨基酸区段，GⅢ位于330-357位氨基酸区段（Tordo N.,1996.Laboratory techniques in rabies.4^th ed.WHO：28-49）。GⅡ和GⅢ不但是诱导产生中和抗体的抗原表位，而且也是G蛋白折叠和运输的必需部分。研究表明G蛋白抗原性变化主要是由GⅡ位点上34-42位、147位、184位、198-200位氨基酸以及GⅢ位点上330-340位氨基酸的替换引起（Benmansour etal.，1991.J.virol.65:4198-4203）。G蛋白上单一氨基酸的改变就能改变RV的抗原性。Irie等用单克隆抗体研究RV G蛋白上的1个构象表位时发现，第36位苏氨酸被脯氨酸替换形成的突变株丢失了这一抗原表位，单克隆抗体不能中和该突变株；第39位丝氨酸被苏氨酸替换形成的突变株虽能与单克隆抗体结合，但其空间构象发生了改变，单克隆抗体也不能中和突变株（Irie T et al.,2002.Microbiol.Immunol.46:449-461）。其他研究者利用抗GⅡ抗原位点的单克隆抗体研究G蛋白的抗原性也得到过类似的结果。G蛋白的结构与RV毒力有关。研究发现，当RV G糖蛋白膜外区330位的赖氨酸和333位的精氨酸分别被天门冬氨酸和甲硫氨酸取代会明显降低糖蛋白和神经瘤细胞之间的相互作用，且形成的双突变RV株对成年小鼠没有致病性。其他研究也发现，当G蛋白的第333位精氨酸被异亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或甘氨酸替换，不管以何种剂量、何种途径感染小鼠，该突变毒株均无致病性（Dietzschold B.et al.,1983.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:70-74；Seif et al.,1985.J.Virol.53:926-934；Tuffereau et al.,1989.Virology,172:206-212；Ito H.et al.,1994.Microbiol.Immunol.38:479-482:Coulon P et al.,1998.J.Virol.72:272-274；Mutsuyo Takayama-Ito M.et al.,2006.Virus research,119:208-215）。此外G蛋白的第164-303位氨基酸与RV对成年鼠的致死性作用有关，其中第242、255、268位氨基酸能增强RV的毒力。最新的研究发现，无致病性毒株的第194位天冬酰胺被赖氨酸替换，能增强RV突变株的传播，提高RV突变株的毒力（Takayama-Ito M.et al.,2004.J.Neurovirol.10:131-135）。