[发明专利]一种新型胶质瘤干细胞的三维培养方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物领域，特别涉及一种新型胶质瘤干细胞的三维培养方法及其应用。

背景技术

恶性胶质瘤作为神经系统中发病率最高的恶性肿瘤，在过去的10年里，即使经历了手术、放射和化学治疗的较大进展，其中位生存期也仅由10个月提高至14个月，并且在针对胶质瘤的多个大型、多中心的新药试验中，都未能取得令人满意的结果，绝大多数的药物在二期临床试验中折戟沉沙，未能体现出与体外试验时相一致的结论。这种体外试验与临床结果不相符的情况在抗胶质瘤治疗研究中普遍存在，预示着目前对于恶性胶质瘤的发病机制、发展特性及抗药机制的认识还有很多的空白，抗恶性胶质瘤肿瘤药物体外试验方法存在着进一步改进的空间。

近年来肿瘤干细胞的发现及研究进展，也为胶质瘤复发、转移及治疗抵抗等关键机制以及在此基础上研发诊疗新技术打开了新的视野，且越来越成为胶质瘤研究领域的热点。胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)因其自我更新、多向分化和对治疗抵抗的能力，是维持肿瘤恶性生长和复发转移的“种子细胞”，因此以GSCs为主要靶向的抗胶质瘤治疗研究也成为抗胶质瘤治疗的新兴重点方向之

那么进行靶向GSCs治疗的研究首先就要求我们有一个针对GSCs进行体外培养的技术以及在此技术之上进行不同于传统的药物学试验方法。在我科以往的抗肿瘤新药研发中，我们主要按照传统的肿瘤药物体外试验方法，即以检测单层培养细胞对药物的反应来进行。该方法由美国国家癌症研究所(NCI)于上世纪八十年代创建，但在临床应用中，常发现体外试验敏感的药物效果与患者体内实体瘤临床评估的药效偏差较大。既有研究表明，这至少部分是由于单层培养的体外细胞生长丧失了三维空间结构，无法相对真实地反映体内肿瘤细胞的病理生理结构、生长状态以及相对耐药耐辐射的肿瘤干细胞水平。

进入GSCs研究时代以后，目前最常用的GSCs体外培养方法是由1992年Reynolds BA等人在从鼠纹状体进行神经干细胞的分离培养中发明的无血清悬浮培养法。该培养方法的特点为：无血清、添加高浓度生长因子的培养液，以及低黏附性培养环境。其优势为：可以比较简单、直观地从细胞层面上体现单个细胞的自我更新及分化能力；但缺陷也很明显：除了成球培养重复性较差，细胞球内难以观测等，更重要的是其与体内环境大相径庭。它无法迁移运动，由单细胞分裂成球而来，无法体现细胞与基质的作用，长期传代成功率极低，而体内肿瘤干细胞绝非悬浮状态，不可运动，其粘附于由其他细胞和基质支持组成的特殊微环境，即特定的“干细胞龛”内，也可以接触到血清成分。

目前应用在制备3D细胞培养的主要材质包括：1.天然有机物：胶原、壳聚糖、葡萄糖氨基聚糖类、藻酸盐、丝心蛋白、琼脂糖、淀粉；2.无机大分子聚合物：PGA(聚乙醇酸)、PLA(聚乳酸)、PLC(聚己内酯)、POE(聚原酸酯)及其多相聚合支架如PLGA等。

因此，目前继续一种新型的胶质瘤干细胞培养方法，以真实地反映体内肿瘤细胞的病理生理结构、生长状态以及相对耐药耐辐射的肿瘤干细胞水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型胶质瘤干细胞的三维培养方法，所述三维培养方法可为细胞提供良好的粘附与迁移环境，并具有良好的生物相容性、机械强度、降解系数和低免疫原性。利用三维细胞培养这种方法将有效的避免不必要的临床I、II期试验，从而减少病人资源和后续研究资金的浪费。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种新型胶质瘤干细胞的三维培养方法，利用三维胶原支架，并摸索出适宜的低血清培养浓度，所述培养方法包括以下步骤：

1)将三维胶原支架切割成1*5*5mm的立方体，使用前Co60照射消毒过夜，4℃干燥环境储存备用，待接种细胞前，以细胞培养液浸泡预处理12小时；

2)将胶质瘤细胞株消化离心至单细胞悬液，再用PBS洗净2遍，以去除血清成份，并进行细胞计数，以每个三维胶原支架1×10⁴～5×10⁴个细胞的密度将胶质瘤细胞接种于步骤1)处理后的三维胶原支架上，静置4小时，待细胞有效粘附于支架上后，置于细胞培养板中培养，每2日更换1次培养液，即得到3D胶质瘤细胞模型。

进一步的，步骤1)中所述的细胞培养液为添加1％胎牛血清的DMEM。

进一步的，所述三维胶原支架的平均孔径为50μm。

进一步的，所述三维胶原支架的材料为I型胶原。

进一步的，胶质瘤细胞株为U87细胞细胞。

本发明相比现有技术的有益效果是：