[发明专利]抗HGF/VEGF双特异性抗体、其制备方法及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种抗HGF/VEGF双特异性抗体、其制备方法及应用。本发明的抗HGF/VEGF双特异性抗体既能与HGF结合，还能与VEGF相结合，可有效地抑制肿瘤的生长，具有良好的抗肿瘤效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类双特异性抗体和其制备方法，以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。

肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过1～2mm，转移则无法实现。血管内皮生长因子（VEGF）是一类能促进血管内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成并能提高血管通透性的生长因子，它们与细胞表面的血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合后，通过激活酪氨酸激酶信号转导通路发挥功能。VEGFR属于酪氨酸激酶受体超家族，它们有相似的结构，均由胞外区、跨膜区、胞内区组成。目前发现的VEGFR主要有3种：VEGFR1（Flt-1），VEGFR2（KDR），VEGFR3。与VEGFR1结合的主要是VEGF-A、VEGF-B，与VEGFR2结合的主要是VEGF-A、VEGF-C、

VEGF-D、VEGF-E，与VEGFR3结合的主要是VEGF-C、VEGF-D。VEGFR1和VEGFR2主要位于肿瘤血管内皮细胞表面，VEGFR1主要介导细胞骨架重排及引起细胞迁移，而VEGFR2介导内皮细胞的增殖、分化；VEGFR3特异表达在淋巴内皮细胞中，在动脉、静脉、毛细血管内皮中基本没有表达。VEGF-C和VEGF-D可通过VEGF-C/VEGF-D/VEGFR3信号系统发挥作用，从而导致肿瘤淋巴管的增生和淋巴结的转移（Neufeld G等，FASEB J，1999，13：9-22）。在肿瘤组织中，

肿瘤细胞、肿瘤浸润的巨噬细胞和肥大细胞等能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长；另外，高水平的VEGF还能提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞浸润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。因此，抑制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。Genentech公司的抗癌新药Bevacizumab（抗VEGF人源化抗体）已于2004年2月获得美国FDA批准上市，目前Bevacizumab与常规化疗药联合应用可用于治疗转移性结直肠癌以及非鳞状的非小细胞肺癌的一线治疗。

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是存在于急性肝损伤动物血浆中的蛋白因子，它能刺激肝细胞的DNA合成，且在肝再生过程中起重要作用。HGF由728个氨基酸构成，其活性形式是由一条69kd重链a和一条34kd轻链b组成的异二聚体，a链N端有一发夹结构；b链有丝氨酸蛋白酶样结构。受体酪氨酸激酶（c-Met）是HGF的特异性细胞表面受体，表达于多种正常组织细胞（如心肌细胞、血管内皮细胞等）和肿瘤细胞的膜表面，介导HGF所有的生物学作用。愈来愈多的报道表明，HGF是一种作用广泛的因子，除对肝细胞作用之外，还对多种组织和细胞具有调控作用，其中最显著的是促细胞分裂和促细胞运动作用。HGF能剂量依赖性地促进血管内皮细胞的增殖，而且HGF刺激内皮细胞增殖的能力明显强于碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和VEGF，提示HGF具有强大的促进血管生成作用。目前已证实，不论是离体还是在体，HGF都能够明显地促进VEGF的mRNA表达，而且这两种细胞生长因子在促血管生成方面具有协同作用。在肿瘤组织中，通过自分泌或旁分泌方式产生的HGF能刺激内皮细胞的分裂和增殖，同时也能促进肿瘤细胞自身的生长和转移。