[发明专利]一种用于预防病毒性心肌炎的重组病毒及其疫苗和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及生物基因技术，尤其涉及一种重组病毒，特别是一种用于预防病毒性心肌炎的重组病毒及其疫苗和应用。

背景技术

病毒性心肌炎主要由B3型柯萨奇病毒（CVB3）感染所致，青壮年发病较高，可导致约50%的人类急性及慢性心肌炎和25%扩张性心肌病的发生，是一常见、多发的心血管系统疾病。目前尚无有效的预防或治疗疫苗。CVB3属于肠道病毒，通过呼吸道、胃肠道入侵机体后，由于机体粘膜免疫（如肠道IgA）不能在感染早期及时清除病毒，使病毒迅速扩散入血、进而侵犯心脏，导致病毒性心肌炎；CVB3的持续性感染还可能导致扩展性心肌病的发生，致死率极高，危害严重。当前导致严重感染性疾病的病原体如人类免疫缺陷病毒（HIV）、流感病毒、严重急性呼吸综合征病毒（SARS-CoV）等均通过粘膜表面（生殖道、呼吸道、胃肠道）入侵和感染机体，由于机体不能诱导有效的粘膜免疫应答清除粘膜感染病原体，使病原体迅速扩散入血、进而侵犯全身，造成机体损伤；同时发展为慢性感染，导致慢性疾病的行成。

对于以上经粘膜感染病原体，如能诱导粘膜局部（鼻咽、胃肠道）的特异性粘膜免疫应答，特别是特异性的SIgA的形成和分泌，则可能在感染初期有效中和病毒，避免病毒入血而后感染全身器官，从而有效的阻止病毒性心肌炎的发生。因此研制出有效诱导SIgA分泌的粘膜疫苗迫在眉睫。

已知常规疫苗如灭活、蛋白疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗等，经常规途径免疫（肌肉注射、皮下等）通常不能诱导特异性粘膜免疫应答。无论疫苗的形式是什么，要诱导粘膜免疫应答通常需要将靶抗原从粘膜部位接种，才能被粘膜中APC摄取并提呈，激活粘膜免疫系统，诱导粘膜免疫应答。

已知的粘膜接种抗原的瓶颈在于：粘膜局部纤毛的频繁物理摆动可迅速清除外来抗原；粘膜局部存在大量酸性溶液，富含水解酶、DNA酶等，可迅速降解外来抗原。因此粘膜部位接种抗原由于被迅速清除和降解，不能在粘膜局部有效停留，使不足以被APC提呈，不能诱导有效的粘膜免疫应答。即使诱导，其应答程度非常低下。

水疱型口炎病毒（VSV）能感染多种动物和昆虫。家畜中自然感染VSV的有马、牛（羊）、猪，而人群中自然状态下几乎不存在水疱型口炎病毒主动感染，对人的感染不会引起很明显的病症，因此将水疱型口炎病毒作为病毒载体疫苗是有潜在的可行性的。水疱型口炎病毒病毒内部为紧密盘旋的螺旋对称的核衣壳，VSV基因组为不分节段的线性单股负链RNA，长约11kb。从3’→5’端依次排列着N、NS（P）、M、G、L等5个不重叠的基因，分别编码核（N）蛋白、磷酸（P）蛋白、基质（M）蛋白、糖（G）蛋白、及RNA聚合酶(L)蛋白等5种不同的主要蛋白。其中核蛋白（N）和糖蛋白（G）在病毒免疫具有重要的意义。N基因编码的病毒核蛋白（N蛋白），它可有效的保护病毒RNA免受各种核酸酶的消化。N基因编码的N蛋白呈群特异性，为许多型和亚型所共有，有高的抗原性，且在转录复制中担任了重要的角色。进入细胞的VSV的N蛋白作为优势抗原被VSV特异性CTL细胞识别，诱导CTL发挥作用，参与免疫反应。因此VSV作为病毒载体携带靶抗原，会增强机体的免疫应答强度，采取的粘膜部位接种免疫方式则会诱导机体产生更强的特异性黏膜免疫应答。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种用于预防病毒性心肌炎的重组病毒及其疫苗和应用，所述的这一种用于预防病毒性心肌炎的重组病毒及其疫苗和应用解决了现有技术中的疫苗对B3型柯萨奇病毒（CVB3）感染所致病毒性心肌炎效果不好的技术问题。

本发明为一种重组病毒，以水疱型口炎病毒为载体，在所述的水疱型口炎病毒的囊膜糖蛋白G和聚合酶蛋白L之间插入编码抗原CVB3结构蛋白VP1基因。

进一步的，所述的编码靶抗原CVB3结构蛋白VP1基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述的CVB3结构蛋白来源于CVB3Nancy株。

进一步的，所述的水疱型口炎病毒来源于水疱型口炎病毒印第安纳株。

进一步的，上述的重组病毒通过反向遗传重组质粒在BHK21细胞中包装出重组的水疱型口炎病毒。

本发明还提供了上述的一种重组病毒的制备方法，通过如下方法制备：

（1）选择靶抗原CVB3结构蛋白VP1基因，以质粒pXN₂为载体，在所述的pXN ₂载体中插入编码靶抗原CVB3结构蛋白VP1基因，得到重组质粒pXN₂-VP1。

（2）在培养皿中培养BHK细胞，待细胞长满40～70%的时候，收集BHK细胞；