[发明专利]一种单粒玉米种子活力快速检测方法

权利要求书

1.一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于：它由以下步骤组成：玉米胚乳核DNA的提取，玉米胚乳核DNA氧化损伤检测，玉米胚乳核DNA活力分析。

2.如权利要求1所述的一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于：所述玉米胚乳核DNA的提取利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）；所述玉米胚乳核DNA氧化损伤检测利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳核DNA中8-OHdG的含量；所述玉米胚乳核DNA活力分析通过建立种子老化模型实现。

3.如权利要求1或2所述的一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于：它由以下步骤组成：

a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；

（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13~0.17 g；

（2）将（1）中所得胚乳和0.9~1.1 ml预热的65℃ 的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；

（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20 min，期间轻轻上下颠倒2次；

（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5 min；

（5）向（4）中所得的胚乳中加入0.9~1.1 ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；

（6）将（5）所得胚乳以5600~6400 g离心力离心5 min，离心后收集上清液；

（7）向（6）中所得上清液中加入0.9~1.1 ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；

（8）将（7）所得物以5600~6400 g离心力离心5 min，离心后收集上清液；

（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；

（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1 小时；

（11）将（10）所得物以5600~6400 g离心力离心5 min，离心后收集沉淀；

（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇0.9~1.1 ml，轻轻上下颠倒3 min；

（13）将（12）中所得物以5600~6400 g离心力离心5 min，离心后收集沉淀，室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；

（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于48~52μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中；

b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量；

胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；

（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5 pg/ml，5 pg/ml，10 pg/ml，20 pg/ml，40 pg/ml，80 pg/ml的 8-OHdG标准液和样品溶液各48~52 μL，向各标准液和样品溶液中分别加第一抗体溶液48~52μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1 h；

（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液230~270 μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；

（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液96~104μL，封盖后在37℃环境中温浴l h；

（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液96~104 μL，封盖后在常温下反应15 min；反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；

（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液96~104 μL，使反应停止，在酶标仪上用450 nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；

（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数即为各样品中8-OHdG浓度；

c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力。