[发明专利]基于胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌及其实现方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其实现方法，具体是一种能够外源表达胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)的大肠杆菌工程菌及其实现方法。

背景技术

木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质，主要包括纤维素、半纤维素和木质素。据估计，每年全世界绿色植物光合作用产生的木质纤维素总干重为1730亿t，所含总能量可达2×10¹⁸kJ，相当于每年全世界消耗能量的10倍。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，它涉及众多酶系的参与。

木质纤维素中的半纤维素组分是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体，这些糖是五碳糖和六碳糖，包括木糖、阿伯糖、甘露糖和半乳糖等。半纤维素主要分为三类：聚木糖类、聚葡萄甘露糖类和聚半乳糖葡萄甘露糖类，其中聚木糖类是以1,4-β-D-吡喃型木糖构成主链，以4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸为支链的多糖；聚葡萄甘露糖类是由D-吡喃型葡萄糖基和吡喃型甘露糖基以1,4-β型连接成主链；另一类聚半乳糖葡萄甘露糖类则还有D-吡喃型半乳糖基用支链的形式以1,6-α型连接到此主链上的若干D-吡喃型甘露糖基和D-吡喃型葡萄糖基上。半纤维素在木质组织中占总量的50%，它结合在纤维素微纤维的表面，并且相互连接，这些纤维构成了坚硬的细胞相互连接的网络。

半纤维素的主要降解酶有内切-β-1,4-木聚糖酶(Endo-β-1,4-xylanases)和β-1,4-木糖苷酶(β-1,4-xylosidase)，此外，半纤维素的降解还需要木聚糖酯酶、α-葡糖醛酸酶(α-glucuronidases)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)和乙酰酯酶(Acetylesterase)等辅助酶的作用。由此可见，内切-β-1,4-木聚糖酶在纤维素的酶降解过程中起重要的辅助作用。

目前，在许多微生物中已经发现并克隆得到α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。与真核生物基因相比，原核生物基因结构简单、无内含子，具有易克隆、易表达及种类多等优势。灰略红链霉菌(Streptomyces griseus)是一种常见的土壤细菌(或放线菌)。灰略红链霉菌之前的研究重点为如何改造其代谢途径以提高抗生素尤其是链霉素的发酵产量，对其基因组内其他功能基因的开发和利用还相对不足。

与大多数细菌相比，链霉菌具有较为复杂的生长、分化机制，基因组较其他的原核生物也更大，可达8-9Mb。一般情况下，链霉菌对大分子多糖物质有很强的分解利用能力，如半纤维素等。因此，研究链霉菌对半纤维素的分解利用机制，发现全新的阿拉伯呋喃糖苷酶基因序列并通过转基因对目的基因进行外源表达，对新型半纤维素酶制剂的开发及生产具有重大意义。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌及其实现方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种基于胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌，能够外源表达胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的DH5α大肠杆菌。

所述工程菌通过以下方式构建得到：

1)设计并合成PCR引物，自灰略红链霉菌JSD-1（CGMCC NO.5706）基因组DNA为模板进行PCR扩增；

所述的PCR引物是指含有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物，具体包括：

正向引物Abl-NdeⅠ-F:

5'-GGAATTCCATATGGCGACCGTGGACACGAACGCCTCGTAC-3'

反向引物Abl-EcoRⅠ-R:

5'-GGAATTCTCAGCGCCGCAGCGTCAGCAGACC-3'

所述的PCR扩增采用PrimeSTAR GXL高保真酶(TaKaRa)进行扩增，PCR扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变形10s，68℃延伸1min；30个循环后68℃终延伸3min。

2）构建具有Sg-Abl基因的质粒：将步骤1得到的PCR扩增产物切胶回收后连接至克隆载体，并导入DH5α大肠杆菌感受态细胞；挑取具有相应抗性的克隆并通过菌落PCR进行鉴定，直至获得阳性克隆后挑取并摇菌提取得到pET-41a质粒。

所述的克隆载体采用pMD^TM19-T Vector。

3）构建具有Sg-Abl基因的表达载体，具体步骤包括：