[发明专利]头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种兽药残留的荧光免疫速测技术，特别是涉及一种用于头孢氨苄残留检测的荧光免疫层析检测试纸条及其制备。

背景技术

头孢氨苄(Cephalexin)是β-内酰胺类抗生素。兽医临床广泛用于控制奶牛的乳房炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害。针对该药物在食品中的残留，我国农业部发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，牛奶中的最大残留限量为100μg/kg，肌肉、脂肪中的最大残留限量为200μg/kg。

目前，用于检测头孢氨苄的方法主要有微生物法、色谱法或色谱-质谱联用分析法、免疫分析法等。微生物检测法操作简单，但其检测周期长且结果误差较大。色谱法或色谱-质谱联用技术虽然灵敏度高，但是样品前处理及测定操作繁琐、费用高，不适于大量样品的快速检测。

Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescent antibody technique)。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用己知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，其中又以荧光抗体方法较常用。基于免疫荧光技术，同时结合色谱层析原理的分析方法称为荧光免疫层析法，以其具有灵敏、快速、特异、简便等优点，广泛应用于现场监控和大规模样品筛查。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查，用于检测牛奶中头孢氨苄药物残留量的荧光免疫层析检测试纸条。

本发明所述的头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条，在背板上依次粘贴经过处理的样品垫、涂覆有荧光标记抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫制成头孢氨苄残留荧光免疫定量层析试纸条。

优选地，所述结合垫上涂覆的稀土荧光纳米颗粒的直径范围为50-100nm。

所述稀土荧光纳米颗粒，可以发射的波长范围是600-630nm，荧光纳米颗粒含有稀土络合物，在基态下是稳定的，在激发光源(340-365nm)的作用下能够发射出波长范围在600-630nm的荧光。

优选地，所述结合垫上涂覆的荧光纳米颗粒标记抗体为稀土荧光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体，硝酸纤维素膜上面包被有检测线为头孢氨苄与卵清蛋白(OVA)制得的包被抗原。

本发明的另一目的在于提供一种头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备方法。

本发明所述的头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

A.头孢氨苄单克隆抗体的具体制备过程为：

(1)动物免疫：采用雌性BALB/C纯系小鼠作为免疫动物，以头孢氨苄与载体蛋白牛血清白蛋白偶联物为免疫原；

(2)细胞融合与克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(3)单克隆抗体的制备与纯化：使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，5天后腹腔注射杂交瘤细胞株10⁶个/只，7天后取小鼠腹水，进行纯化后得单克隆抗体分装，-20℃保存。

B.荧光纳米颗粒的醛基化：

取2mg荧光纳米颗粒(20mg/mL，100μL)，以25mM的碳酸盐缓冲液(pH＝9.5)洗涤3遍(12000r/min，4分钟)后悬浮于100μL上述碳酸盐缓冲液中。加入120μL醛基化的葡聚糖，混匀，短时超声，避光反应3-4小时(室温)。以上述碳酸盐缓冲液洗涤3遍(12000r/min，4分钟)后，悬浮于100μL碳酸盐缓冲液中。1500r/min离心1分钟，去除杂质，放置在4℃备标记抗体之用。

C.荧光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体的制备：

将0.5mg头孢氨苄单克隆抗体用碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，与上述醛基化的荧光纳米颗粒混合，4℃反应过夜。然后，加入硼氰化钠，终浓度为5mM，4℃反应2-4小时。再加入等体积的封闭液(50mM tris-HClpH7.8，含2％BSA、4％蔗糖)，封闭12小时或过夜；最后用50mM tris-HCl pH7.8洗涤标记好的抗体3遍(12000r/min，4分钟，4℃)，然后用100μL50mM tris-HCl pH7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.05％Tween-20)悬浮，4℃避光储存备用。