[发明专利]一种用于高GC含量基因的PCR扩增添加剂组合物及高GC含量基因的PCR扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于高GC含量基因的PCR扩增添加剂及高GC含量基因的PCR扩增方法，属于生物工程技术领域。 

背景技术

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。PCR过程一般分为变性、退火、延伸3个阶段，首先DNA在高温条件下发生变性解链，在温度降至55℃左右时引物与模板DNA单链结合，然后在DNA聚合酶的作用下进行DNA合成。与之前常用的细菌扩增靶基因相比，它具有特异性强、灵敏度高、简便、重复性好、易于自动化等优点。PCR技术发展到今天已经有近30年的时间，随着技术的不断进步，使它更适合实际应用，但其在扩增高GC含量序列方面仍有不足之处。碱基A、T之间形成2对氢键，G、C之间形成3对氢键，因此高G、C含量基因解链所需能量高，变性困难，并且模板中容易形成稳定的二级结构妨碍DNA聚合酶在模板上进行DNA合成而导致扩增失败。人们也尝试了很多方法来提高高GC含量基因特异性扩增产率，包括热启动、两步PCR、Slowdown PCR等方法。然而这些方法只针对某些靶基因扩增有一定的效果，使用范围较为局限。 

从PCR技术发明以来，人们就开始了对PCR反应添加其它化学物质以提高靶基因产率的研究。到目前为止，已经报道了许多添加剂以其各自的特点在不同方面对PCR反应起着促进作用，包括甜菜碱、DMSO、甲酰胺、甘油、7-deaza-dGTP等。7-deaza-dGTP是一种dGTP类似物，经它修饰后的模板，在PCR反应过程中能够避免二级结构的产生，使引物易于与模板结合。甜菜碱是一种中性物质，在PCR反应中，它可以与DNA大沟中的A、T对结合而影响延伸反应，或者通过与DNA小沟结合，使二级结构易于打开，保证扩增的顺利进行。甜菜碱的另外一个优点是对酶的保护作用，它可以提高酶热变性所需温度，保证聚合酶在高温变性过程中不失活。DMSO作为一种PCR增强剂，它的作用原理是通过破坏 了模板DNA大沟与小沟里带有供体和受体的互补氢键，降低DNA二级结构的形成，增加引物与模板的特异性结合，降低非特异性扩增。但有报道称当DMSO浓度过高时会影响DNA聚合酶活性，因此在使用时，要平衡模板、引物、酶的用量。甲酰胺可以促进引物与模板的退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度，从而显著提高PCR反应的特异性。甘油可以提高产量，增加酶的稳定性。 

现有技术中，采用有机溶剂如乙二醇、乙酸乙酯、正戊烷等增高GC含量DNA片段扩增效率的方法，其缺点为所涉及有机溶剂对人体有害，使用不便。所以以对人体无害的化合物为研究对象，表明不同组分及比例搭配对扩增高GC含量模板PCR产物效率作用的研究尤为重要。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于高GC含量基因的PCR扩增添加剂组合物及高GC含量基因的PCR扩增方法。 

本发明的用于高GC含量基因的PCR扩增添加剂组合物，所述的扩增添加剂选自7-deaza-dGTP、甜菜碱、甜菜碱类似物、DMSO、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2种或2种以上的组合，所述的7-deaza-dGTP的工作浓度为0.05-0.2mmol/L；所述的甜菜碱和甜菜碱类似物的工作浓度为0.05-0.5mol/L；所述的DMSO的工作浓度为1-10%（v/v）；所述的甘油的工作浓度为1-20%（v/v）；所述的甲酰胺的工作浓度为1-10%（v/v）；所述的聚乙二醇的工作浓度为1-20%（v/v）。 

本发明中各个成分的“工作浓度”是指其在PCR体系中的浓度。 

本发明中的“甜菜碱类似物”为含有下列主干结构的化合物。 

本发明的高GC含量基因的PCR扩增方法，包括如下步骤： 

1）准备PCR反应体系：包括DNA聚合酶、缓冲剂、dNTP、上游引物、下游引物、DNA模板、双蒸水和PCR扩增添加剂组合物； 

2）进行PCR扩增程序： 

①预处理：95℃变性8min后暂停，加入DNA聚合酶； 

②PCR反应：95℃变性40-60s，在50-65℃退火40-60s，72℃延伸50s-120s，共25-35个循环； 

③延伸：72℃延伸10min； 

④扩增结束后温度降至4℃保存。 

优选地， 

在PCR扩增程序的步骤①和②中的变性温度为95℃。 

只需在步骤①中加入一次DNA聚合酶。