[发明专利]基于多肽的黑色素瘤生物标记物的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种标记物的检测方法，特别是涉及一种基于多肽的黑色素瘤生物标记物的检测方法。

背景技术

作为一种极具侵袭力和高死亡率的肿瘤，黑色素瘤的特征主要表现在转移方式的不可预测性和高度的复发和死亡风险，即使在手术治疗后，患者的复发和死亡的风险仍然存在。因此，及时监测肿瘤的进展和复发非常重要。近年来的研究结果表明，S100B(靶蛋白)是一种独立的黑色素瘤生物标记物，它不仅与肿瘤的分期、疾病的进展和复发密切相关，而且还能提供黑色素瘤患者的预后信息并预测相应的治疗效果。基于黑色素瘤生物标记物S100B这些独特的生物学意义，目前已有相关文献报道：作为黑色素瘤的生物标记物，S100B明显优于乳酸脱氢酶LDH，尽管乳酸脱氢酶是目前唯一应用于黑色素瘤临床实践的标记物。

检测黑色素瘤患者外周血S100B的含量是实现上述生物学意义的基础。目前已有的检测方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫发光分析法(LIA)等，这些方法都依赖于高亲和力的抗体去识别靶蛋白S100B。依赖抗体识别靶蛋白具有一定的局限性，主要体现在：(1)抗体作为一种蛋白，具有较复杂的化学结构，因而不能通过人工合成实现。(2)抗体的生产需要细胞株或者动物，生产过程复杂且生产周期较长；(3)抗体相对价贵且不稳定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于多肽的黑色素瘤生物标记物的检测方法，其具有良好的灵敏性和特异性，并具有简单低耗等优点。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种基于多肽的黑色素瘤生物标记物的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：

步骤一，金电极的预处理，3mm直径的金电极依次经P3000、P5000的碳化硅砂纸打磨，1μm、0.3μm的氧化铝粉抛光，无水乙醇和双蒸水各5min的超声清洗；随后将电极浸泡在水虎鱼溶液5min及50％的硝酸30min；最后由0.5M的硫酸电化学激活金电极；经上述处理的金电极首先与50μL信号肽溶液4℃条件下孵育16小时，随后室温条件下将电极浸泡在100μMMNH溶液3小时占位，以阻断电极表面的非特异性吸附；

步骤二，将预处理的金电极与不同浓度的黑色素瘤生物标记物S100B或生物学样本30℃温育2.5小时；同时将2.5μM信号肽溶液与氯化铜30℃条件下按浓度比1∶1温育以形成信号肽-铜离子复合物；与靶蛋白或生物学样本温育后的金电极经双蒸水冲洗，随后与信号肽-铜离子复合物溶液30℃条件下温育2.5小时，随后即可记录下铜离子的输出信号。

优选地，所述金电极浸在1ml含有过量邻苯二胺和1ul HCL的底物溶液中50℃水浴30min；之后即可在底物反应溶液中记录下具电化学活性的磷酸二铵的输出信号。

本发明的积极进步效果在于：S100B的生物识别和信号输出都通过简单的多肽实现。目前越来越多的文献认为多肽具有很多优点，这些优点使得在某些情况下，多肽是一种比抗体更合适的选择。首先，很多多肽都能与相应的靶蛋白特异性的结合，这种结合具有高度的亲和力，因而可以实现对靶蛋白的生物识别；其次，多肽的化学结构简单明确，因而可以直接人工合成；再次，因为多肽具有简单的化学结构，因而我们可以根据不同的需要对多肽进行进一步的修饰；最后，通过与某些金属离子结合，多肽可以作为信号输出的载体，这与相对传统的检测方法的信号输出方式相比，更加简单易行。我们在与靶蛋白特异性结合的多肽上修饰了一个GHK基序，这个基序可以作为铜离子的螯合剂，铜离子具有电化学活性，因而螯合了铜离子的多肽可以将生物识别转换为电输出信号。此外，铜离子还能作为邻苯二胺氧化的催化剂，反应生成同样具有电化学活性的二氨基吩嗪。建立在催化基础上的电化学信号放大策略使得本方法的检测灵敏性明显提高。

附图说明

图1为本发明的检测原理示意图。

图2a为本发明的捕获肽修饰的电极分别经不同浓度S100B、2.5μM络合了铜离子的信号肽孵育后得到的SWV信号图。图2b为3nM S100B组和空白对照组分别扫描得到DAP的CV信号曲线。

图3a为检测不同浓度S100B得到的DAP的SWV信号图。图3b显示的是SWV的信号峰值与S100B浓度的对数值呈线性相关

图4为DAP的SWV信号图用以显示本方法对S100B、BSA和空白对照的选择性。

图5检测手术前后黑色素瘤患者血样本得到的DAP的SWV信号图。