[发明专利]一种白癜风动物模型的构建方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及利用莫诺苯宗联合胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸(cytosine-phophate-guanine oligodeoxynucleotide，CpG ODN)诱导小鼠白癜风模型的构建方法。

（二）背景技术

白癜风是一种皮肤T细胞介导的自身免疫性疾病，以为局部或泛发性色素脱失为主要表现。近年来白癜风发病率逐年上升，其病因尚未明确，发病机制学说众多，如自身免疫学说、黑素细胞自身破坏学说、神经化学因子学说、黑素细胞生长因子缺乏学说、遗传因素等。很多学者在白癜风实验研究方面做了大量的工作，取得了很大进展，建立合理的白癜风动物模型有助于我们更加深入研究白癜风的发病机制和防治措施。

莫诺苯宗的脱色作用主要是通过酪氨酸酶与活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的相互作用完成。起初通过黑素小体自噬作用和酪氨酸酶的泛素化作用，提呈黑素小体相关抗原并在表面产生MHC（主要组织相容性复合物）Ⅰ和II分子，直接诱导CD8⁺T和CD4⁺T反应，形成黑素细胞特异性抗体，这一现象在白癜风患者体内可观察到。此外，低水平表达的ROS可以加快外源性抗原分泌物的排泄，从而促进树突细胞提呈黑素细胞特异性抗原，形成CD8⁺T细胞自身抗原；莫诺本宗接触皮肤后形成的醌半抗原可能激活自身免疫反应，NLRP3的病毒相关性抗原触发炎症反应，并且在局部有树突细胞和角质形成细胞，这种自身免疫反应激活DCs分泌TLR-7和TLR-9及角质形成细胞分泌TLR-9。ROS可能间接促进来自莫诺苯宗暴露细胞的ATP释放，进一步促进局部DC刺激病毒感染相关抗原引起NLRP3炎症反应，这些促炎症反应的细胞因子激活NK细胞作用。半抗原特异性CD8+T细胞通过杀灭处于表面的莫诺本宗暴露的黑素细胞，这些黑素细胞分解碎片并被吞噬细胞摄取，从而增加血清中抗原特异性抗体形成免疫复合物，通过溶解莫诺本宗暴露细胞和释放相关细胞因子，引起远处出现免疫反应。

CpG就是其中的一种新型佐剂，是人工合成的以未甲基化的CpG二核苷酸为核心的寡核苷酸序列，CpG除对非特异性免疫有影响外，还能提高共免疫抗原的特异性免疫应答，不仅提高细胞毒性T细胞反应，而且能提高免疫球蛋白的产量，因而已引起人们的广泛关注。CpG可能直接活化B细胞和巨噬细胞，诱导它们分泌IL-6、IL-12和TNF-a等细胞因子，这些细胞因子激活B、T细胞或受Thl型细胞因子的作用，使机体特异性细胞与体液免疫反应同时增强。基于以上，我们通过莫诺苯宗联合CPG诱导小鼠产生白癜风具有可行性。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种新的白癜风动物模型，特别是利用莫诺苯宗和胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸构建白癜风动物模型。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种白癜风动物模型的构建方法，所述白癜风动物模型按如下方法构建：用质量浓度20～60%莫诺苯宗乳膏溶液或乳化制剂（所述溶液或乳化制剂是指能够溶解莫诺苯宗且对皮肤无其他副作用的介质），在小鼠背部涂药，每日一次，涂药量以莫诺苯宗质量计为每平方厘米的体表面积予以5-20mg（优选5～15mg），然后在小鼠使用莫诺苯宗溶液或乳化制剂部位的皮下注射胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液（CPG），隔三天一次，每次注射量以胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸质量计为每克小鼠体重予以10～15μg，经过21～50天的培养即造模成功；所述CPG溶液是将CPG用pH值为7.4的PBS缓冲液配置成CPG溶液。

进一步，优选所述莫诺苯宗乳化制剂为水包油型莫诺苯宗乳膏。

进一步，所述水包油型莫诺苯宗乳膏质量组成为：莫诺苯宗200～600g，硬脂酸27g，十八醇27g，液体石蜡54.15g，月桂氮卓酮6.075g，三乙醇胺2.1g，甘油104.325g，羟苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二钠0.3g，蒸馏水补足至1000g。

进一步，所述水包油型莫诺苯宗乳膏的质量浓度优选为35～40%，更优选40%。

本发明所述水包油型莫诺苯宗乳膏按如下方法配制：按配方量，将乙二胺四乙酸二钠、甘油、羟苯乙酯、三乙醇胺加入适量水中，在水浴上加热至80℃左右，搅匀，制成水相，80℃保温，备用；取莫诺苯宗、硬脂酸、十八醇、月桂氮卓酮与液体石蜡混合，加热至80℃，搅匀，制成油相，80℃保温。随即将水相慢慢加入油相中，立即快速搅拌至凝，即得水包油型莫诺苯宗乳膏。