[发明专利]基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂盒

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂盒。

（二）背景技术

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升的趋势。据统计，全球每年新增肝癌患者约60万，其致死率达到第3位，仅仅稍次于肺癌和胃癌。我国每年新增的肝细胞癌发病人数约占全球55%；肝癌防治的核心是早期发现、早期诊断和早期治疗。其中早期诊断最为关键，即在患者出现临床症状前或在癌症发生浸润前得以确诊，从而得到及时治疗，达到提高治愈率、降低死亡率的目的。磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（glypican-3，简称GPC3）在1996年被Pillia等人首先发现，其相对分子量约66kDa，基本结构包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素链和糖基磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidylinositol，简称GPI），并通过GPI锚定于细胞表面，在生长发育和癌变过程中起关键作用。科学研究表明，GPC3在大多数HCC中有表达甚至高表达，而在正常肝组织及良性肝脏病变中弱表达或不表达，对HCC的诊断具有较高的灵敏度和特异性，同时GPC3的表达量与HCC的预后也有一定的关系。因此GPC3有望成为HCC早期诊断和预后的新型分子标志物。目前可溶性GPC3作为HCC病人早期诊断的血清标志物的有效性已经得到证明，因此血清中GPC3含量的高灵敏检测对肝癌的早期诊断及预后判断具有重要意义；然而血清样本中GPC3浓度通常低至ppb，为了能够准确检测血清样本中GPC3的确切含量，则对检测方法的灵敏度提出了更高的要求，目前仍然缺乏快速、简便、高灵敏度的GPC3蛋白血清分析检测技术。

免疫分析是利用抗原和抗体间的特异性反应进行生化样品检测的一种分析方法，在临床诊断和生化分析等领域具有广泛的应用。其中酶联免疫吸附法（ELISA）具有操作简便、易于标准化等特点，是应用最广的抗原检测方法。目前，血清GPC3含量的检测主要通过ELISA进行，然而ELISA存在价格昂贵、稳定性差、灵敏度不够等诸多问题。

近年来各类荧光纳米材料广泛的应用于生物医学检测中，尤其是将免疫反应的特异性和荧光纳米材料的敏感性相结合，可以准确、特异、灵敏、快速的检测一些微量甚至超微量物质，有望解决ELISA检测中灵敏度低和稳定性差等问题。量子点具有吸收波长范围宽、发光寿命长和不易漂白等优点，被称为最有潜力的荧光标记物质，目前被广泛应用于各类免疫分析的荧光标记研究中。

本专利将结合免疫分析技术和新型ZnSe纳米晶，开发肝癌标志物（GPC3）的快速、特异和高灵敏检测新方法。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂盒。

本发明采用的技术方案是：

一种基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂盒，主要包括：表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶，锌离子荧光探针溶液，GPC3抗体和GPC3蛋白标准品。上述为试剂盒的主要试剂组成，未包括检测过程中所用的常规缓冲液，如包被缓冲液、洗涤缓冲液和封闭缓冲液等。试剂盒中GPC3抗体是用于包被吸附于酶标板上，简称吸附抗体，交联修饰在ZnSe纳米晶表面的GPC3抗体（该抗体和前述的吸附抗体对应GPC3蛋白的不同识别位点）用于检测GPC3，简称检测抗体。所述ZnSe纳米晶与GPC3检测抗体可直接或间接交联，优选为直接交联，所述ZnSe纳米晶粒径为1～10nm。

优选的，所述表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶由如下方法制备得到：取ZnSe纳米晶粉末加入磷酸缓冲溶液中，并相继加入足量的EDC和NHS，活化15～30分钟，过量的EDC用巯基乙醇进行淬灭，之后加GPC3抗体于37℃涡旋交联3～6小时，GPC3抗体与ZnSe纳米晶质量之比为1﹕1，交联过后经离心过滤纯化，即得所述表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶。所述表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶通常需用磷酸缓冲溶液（pH7.2）进行分散，储存备用。

所述GPC3蛋白标准品优选为人重组GPC3蛋白，可作为免疫原或GPC3蛋白标准品。所述的GPC3吸附抗体为兔抗人、鼠抗人、鸡抗人或其他GPC3抗体，使用时所述GPC3吸附抗体稀释至蛋白含量为1～100μg/mL。优选的GPC3吸附抗体与GPC3检测抗体为同源且识别GPC3蛋白不同序列。