[发明专利]一种新型单糖荧光衍生方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的荧光衍生试剂及其使用方法，并涉及将其应用于生物样品的单糖组分分析。

背景技术

随着科学研究的发展，人们逐渐认识到由不同单糖组成的糖链是除蛋白质和核酸外体现生命现象的第三类生物大分子，糖链的研究已被公认为继蛋白质和核酸的研究后探索生命奥秘的第三个里程碑。

糖链在生物体内发挥着重要作用，如细胞识别，细胞相互作用，炎症和疾病恶化等。另外，糖链是很多病毒、细菌等的受体，并作为肿瘤的标记物受到越来越多的关注。

然而，由于糖链结构的复杂性和多样性，其研究进展远远落后于蛋白质和核酸的研究，而单糖组分研究是深入研究糖链结构和功能的第一步。由于糖分子本身不具有（或只具有极弱的）发光性，人们通常先将糖进行化学衍生标记，使其具有较强的紫外或荧光吸收，然后经高效液相色谱或毛细管电泳等技术进行进一步解析。

目前，人们已经开发出多种单糖衍生标记化合物如2-氨基吡啶（2-PA）、2-邻氨基苯甲酸（2-AA）和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）等，但这些方法都存在着一定局限性：如使用2-PA时需要过葡聚糖凝胶柱除去过量的2-PA，这使得样品准备需要大量的时间以及造成样品损失；使用2-AA标记葡糖胺时，会有15%的葡糖胺异构成甘露糖胺；而PMP标记时也需要经过多次乙醚萃取除去过量PMP，并且PMP标记的糖定量效果不可靠。基于以上原因有必要开发出一种能够避免上述缺陷的新的糖荧光衍生方法。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种新的荧光衍生试剂。本发明所使用的化学衍生物本身不具有荧光特性，与还原糖发生化学反应后能够使糖具有荧光特性，因此反应后无须去除多余的衍生物从而可以快速地进行HPLC分析，此外此方法可实现对糖的定量分析。

本发明的另一目的是提供一种将上述荧光衍生试剂应用于单糖组分分析的方法。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

式（I）所示的非荧光化合物在作为还原糖的荧光衍生试剂方面的应用，

其中，Ar为杂芳基，优选的Ar为吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基或吡唑啉基，最优选为吡啶基。

本发明包括一种单糖荧光衍生方法，将一种或多种还原糖，或者含有一种或多种还原糖的溶液，与碱和式（I）所示的非荧光化合物进行缩合和环化脱水反应，得到用于单糖结构定性或定量检测的荧光标记产物；所述还原糖选自己糖、己糖衍生物、戊糖或戊糖衍生物中的一种或几种。

本发明所适用的还原糖包括己糖和戊糖，以及被修饰的己糖和戊糖。如C3，C4，C5和C6位置上的羟基有一个或多个被R基取代的还原糖。进一步的，本发明的还原糖选自式（II）或式（III）化合物中的一种或几种，

其中，R₁、R₂、R₃或R₄分别独立地选自氢、羟基、氨基、乙酰基、羧基、磷酸基、卤素、硫酸基或糖基。

优选的，R₁、R₂或R₄分别独立地选自羟基，R₃选自氢或羟基；进一步优选的，还原糖选自半乳糖、甘露糖、古洛糖、甘露糖、阿拉伯糖、芹菜糖、木糖、岩藻糖或鼠李糖中的一种或几种。

本发明中的碱为碳酸氢钠或碳酸氢钾，碱的用量为还原糖总质量的0.1～1倍，具体可根据反应进行调整；反应溶液选自水和/或甲醇；反应温度为50～130℃。本发明得到的荧光标记产物的激发波长为300-600nm，吸收波长为360-650nm。

在本发明中，采用新的荧光衍生试剂，还原糖与其活泼亚甲基经缩合并进一步经分子内环化脱去一分子水形成荧光标记产物。其反应原理如下：

本发明进一步提供了一种单糖荧光衍生测定方法：将一种或多种还原糖，或者含有一种或多种还原糖的溶液，与碱和式（I）所示的非荧光化合物进行缩合和环化脱水反应，得到荧光标记产物，采用HPLC方法以激发波长300-600nm、吸收波长360-650nm进行测定得到的标记产物。其中各反应原料和条件如上所述。

本发明的有益效果：

本发明所使用的荧光衍生试剂不具有荧光特性，与还原糖发生化学反应后能够使糖具有荧光特性，因此反应后无须去除多余的衍生物从而可以快速地进行HPLC分析，此外，此方法中衍生物能够与糖进行分子量1：1的反应从而实现对糖的定量分析。

附图说明