[发明专利]脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法

说明书

技术领域

本发明涉及脱氧核糖核酸的分离与纯化的技术领域，尤其涉及用于洗脱脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法。

背景技术

固相萃取是一个包括液相和固相的物理萃取过程，在萃取过程中，固相对分析物的吸附力大于样品基液，当样品接触固相吸附材料时，分析物被吸附在固相吸附材料表面，再采用适当的溶剂将分析物洗脱下来。本申请中固相吸附材料是不溶的，具有能够与核酸主链的磷酸基团相互作用的表面的基质。固相吸附材料可以是多孔或非多孔颗粒、粉状颗粒或者纤维的形式，可以是纳米尺寸，也可以是微米尺寸，其基质表面可以修饰上指定的基团。而树枝状大分子是一类结构高度支化，规整精致，表面具有很高的官能团密度的新型高分子，其结构包括内核、与内核相连的重复单元内部结构，与最外层重复单元连接的尾部基团。最常见的是聚酰胺-胺结构的树枝大分子。

脱氧核糖核酸（DNA）在生物体内的含量较低。因而，高效、简便的DNA提取方法是影响后续分子生物技术如测序、变异分析、克隆等质量的重要一环。固相萃取法分离纯化DNA是利用某些固相介质，在某些特定的条件下，DNA被特异性地吸附在固相表面，再通过选择不同的洗脱条件，将杂质和DNA分步进行洗脱，从而获得纯化的DNA样品。

本领域内共知的基于有机溶剂的液相提取方法，如酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法等获得的DNA纯度比较高，能够满足后续的各种实验的要求。但是缺点也很明显，操作繁琐、用时长；而且，所用试剂具有一定的毒性。1979年，Vogelstein和Gillespiet首次在琼脂糖凝胶中加入高浓度碘化钠，使琼脂糖凝胶溶解，在该溶液中加入玻璃粉末，由于高浓度碘化钠的存在，扰乱了玻璃粉末表面上液态水的有序结构，使DNA吸附在玻璃粉末表面，经过离心后，用纯净水使DNA解吸，从而完成DNA的提取。相比于有机溶剂提取，这种提取方法操作方便、快速、不需要大量的有机溶剂，并且克服了液相提取中相分离不完全的缺点。因而，基于固相材料吸附-液相洗脱液解吸附的DNA提取方法越来越受到重视。但是由于Vogelstein和Gillespiet的提取法回收率仅在70%左右，后续的研究的重点之一旨在进一步提高回收率。

目前最常见的提高回收率的研究是从吸附机理上入手，提高DNA的吸附效率。由于DNA碱基上磷酸根的pKa约为1.2，其在很宽的pH值范围内都带负电，因而在固相吸附材料的基体表面键合上带正电荷的基团，通过静电引力作用可以显著提高吸附效率。Liu等人在石英材料表面键合上氨基对DNA进行萃取，Matsunaga等将聚酰胺-胺（PAMAM）树枝大分子键合在磁性纳米材料表面对DNA进行固相萃取，由于DNA和PAMAM的氨基之间结合力强，在洗脱液中加入2M氯化钠对DNA进行洗脱。2012年Tanaka等在一篇报道中使用相似的固相吸附方法，采用的洗脱液为1M磷酸盐，在吸附过程中需要加热到80℃。但是上述采用高盐溶液对DNA解吸的方法并不能有效克服DNA和固体吸附剂表面带正电基团的引力，洗脱能力较低。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法，所述洗脱液对脱氧核糖核酸的洗脱率较高。

有鉴于此，本申请提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱液，包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5～13。

优选的，所述酸碱缓冲溶液为磷酸盐、磷酸、金属氢氧化物、碳酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、硼酸和硼酸盐中的一种或多种。

优选的，所述离子液体为溴化1-烷基-3-甲基咪唑、氯化1-烷基-3-甲基咪唑、1-烷基-3-甲基咪唑四氟化硼、1-烷基-3-甲基咪唑六氟化磷和1-烷基-3-甲基咪唑三氟甲烷璜酰亚胺中的一种或多种。

优选的，所述酸碱缓冲溶液的浓度大于0且小于等于50mM。

优选的，所述酸碱缓冲溶液的浓度为3～20mM。

优选的，所述洗脱液的pH为9～12。

本申请还提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱方法，包括：将固相吸附材料吸附的脱氧核糖核酸在洗脱液中进行洗脱；所述洗脱液包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5～13。

优选的，所述洗脱的时间为2min～20min。

优选的，所述离子液体的浓度与所述脱氧核糖核酸的碱基浓度比为（0.1～500）：1。

优选的，所述离子液体的浓度与所述脱氧核糖核酸的碱基浓度比为（0.5～100）：1。