[发明专利]一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法

说明书

技术领域

本发明属于生物学领域，具体而言，涉及一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法。

背景技术

粘孢子虫（Myxosporea）是一类种类繁多的寄生虫。目前，发现的粘孢子虫种类已超过2200种，并且每年都有新种被发现。除少数种类寄生在两栖动物、水禽及哺乳动物外，绝大多数寄生于鱼类不同组织器官上，严重影响寄主的健康生长。粘孢子虫作为最为常见的鱼类等水生动物寄生虫之一，经常在科研或教学中被研究观察。

目前最常用的粘孢子虫的观察方法：事先把患粘孢子虫的病鱼保存在福尔马林溶液中，需要观察时，从溶液中取出粘孢子虫的孢囊，制作水浸片，然后在显微镜下观察。这种方法明显有如下缺点：其一、粘孢子虫基本透明，在显微镜下折光率低，不容易看清楚其形态结构（图2、图4、图6）；其二、水浸片中的粘孢子虫位置不固定，会随液体而流动，不利于显微镜下虫体结构观察和拍照；其三、每次观察都要制作水浸片，耗时耗力，浪费粘孢子虫样品和玻片；其四、用于长期保存粘孢子虫的福尔马林溶液有效成分为甲醛，有刺激气味，有毒，制作水浸片过程影响使用者身体健康。

发明内容

为了弥补上述缺陷，本发明自创出一种简单易行，便于携带，观察效果好，一次做好可常年保存并且可反复使用的粘孢子虫玻片标本的制作方法，以期给寄生虫实验科研和教学带来便利。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明涉及一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）粘孢子虫悬浮液制作：从保存于福尔马林中的患粘孢子虫病病鱼上取出孢囊放入适量蒸馏水中，弄破孢囊使得粘孢子虫分散悬浮于蒸馏水中，粘孢子虫悬浮液中的孢子虫尽可能有较高浓度，一般以0.01～1×10⁶/ml为最宜；

（2）甘油蛋白粘性玻片制作：用大头针取芝麻大小的甘油蛋白均匀涂在载玻片上，用滴管滴2～3滴粘孢子虫悬浮液于甘油蛋白粘性玻片上，摇晃玻片使粘孢子虫悬浮液均匀地分布于玻片上；

（3）烘片：把带有粘孢子虫的玻片在38～42℃干燥箱里烘干，以玻片上液体刚蒸发了为止；或者可以自然条件下晾干；

（4）染色：用滴管吸取瑞氏-姬姆萨A液（常规血细胞染色用瑞氏染液和姬姆萨1：1混合液）0.5～0.8ml覆盖于带有粘孢子虫的烘干玻片上，染色5～8min；再将瑞氏-姬姆萨B液（pH=6.4～6.8的磷酸盐缓冲液）滴加于A液上，滴加量是A液的3倍，以嘴或洗耳球吹出微风使得液面产生涟漪状而充分混合，染色8～10min；用蒸馏水缓慢细流冲掉玻片上多余的染料，直到流下的蒸馏水变为无色为止；

（5）脱色洗片：把染好的玻片浸入甲醇溶液中1～3min进行脱色洗片；

（6）脱水及封片：脱色的洗片依次经过70%、80%、95%、100%梯度酒精分别脱水2min，然后分别经二甲苯纯酒精1：1混合液和二甲苯2min后用中性树胶封片。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的甘油蛋白为甘油（丙三醇）与鸡蛋蛋清1:1体积比的混匀液。

本发明中，粘孢子虫（Myxosporea）是一类种类繁多的寄生虫。目前，发现的粘孢子虫种类已超过2200种，并且每年都有新种被发现。除少数种类寄生在两栖动物、水禽及哺乳动物外，绝大多数寄生于鱼类不同组织器官上。为了在取材上更具代表性，本发明的技术方案选用标本是单极囊的武汉单极虫（Thelohanellus wuhanensis）和双极囊的咽碘泡虫（Myxobolus pharynae），两种虫体均属于碘泡虫属（Myxobolus Bütschli,1882），碘泡虫属是粘孢子虫种类最多的一个属，目前已经超过820种，超过粘孢子虫全部种类的1/3。所以，虽然本发明优选了单极囊的武汉单极虫和双极囊的咽碘泡虫，但本发明的方法具有普遍意义，其它粘孢子虫的染色封存也可以采用该方法进行。

本发明所述的方法具有如下优点：

（1）用玻片标本成品观察粘孢子虫形态效果好：在40倍物镜下，粘孢子虫孢质被染成深蓝色、极囊被染成浅紫红色、壳片不着色，这样极囊、孢质和壳片界线分明，整个孢子的形态结构显得一目了然（图3、7）；在100倍油镜下，极囊极丝着色较深，极囊其它部分着色较浅，极丝的结构显得清晰可见（图5）。这样就克服了传统粘孢子虫显微镜下观察，折光率低，虫体形态结构不清晰的弊端。

（2）标本制作最后采用梯度酒精脱水后中性树胶封片，做好的玻片标本可常年保存样品，多次重复使用，节约玻片等耗材，而且携带方便，可作为实验教学上粘孢子虫形态结构观察玻片标本实验材料。