[发明专利]一种生产白术脱毒苗的方法

权利要求书

1. 一种生产白术脱毒苗的方法，其特征在于：包括以下操作流程：

1.白术种子的预处理及其胚的无菌萌发：购买的白术种子的处理方式为：蒸馏水浸泡12h，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡60s，无菌水冲洗2-3次，再置于10%次氯酸钠溶液中10min，期间搅拌，无菌水冲洗5-6次，倾尽无菌水待用；使用经过高压灭菌的枪状镊和医用镊子将消过毒的白术种子置于无菌皿中去皮剖开，并拔取种胚部分，将白术胚接种于初代培养基中：1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂粉6g/L，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；接种一周后，观察到种胚开始萌发；

2.增殖培养：培养40-60天待苗长到2-3cm左右，在超净工作台上将苗从培养瓶中取出，置于无菌皿中，修剪后转接到增殖培养基中：MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+琼脂粉6g/L，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；40d后，统计得平均增殖倍率达到3.5；

3.病毒检测：将增殖苗从培养瓶移出，剪取0.2g茎叶进行病毒检测，采用ELISA检测法，步骤如下：

1）将待检样品加入盛有通用缓冲液GEB的研钵充分研磨，然后用移液枪移取100μL于聚苯乙烯板的反应孔中，同时做阳性、阴性及空白对照孔，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用磷酸盐吐温缓冲液PBST润洗3次，每次3min；

2）加封闭液脱脂奶粉ECM，每个反应孔200μL，置于37℃孵育1h；1h后，用PBST缓冲液润洗3次，每次3min；

3）加新鲜稀释的抗体，在每个反应孔中加100μL，置于37℃孵育2h；2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min；

4）于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体100μL，置于25℃孵育2h；2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min；

5）于各反应孔中加入碱性磷酸酯酶PNP底物溶液100μL，置于37℃进行暗培养，过夜；

6）结果检测：在酶标仪上，于405nm处，以空白对照孔调零后测各个反应孔的OD值，若大于阴性对照OD值的2倍，则为阳性；

ELISA检测结果显示，90%的胚培养苗不含病毒，将含病毒的白术苗舍去，不含病毒的白术苗继续增殖培养；

4.生根培养：在超净工作台上，将培养到4cm左右的白术组培无根苗直立插入到生根培养基中：1/2MS+1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；一个月后，组培苗平均生根数可高达8条/株；

5.炼苗移栽：当白术组培苗根长≥1cm时，将培养瓶从组培室移出，置于炼苗室常温闭瓶炼苗4d，旋松盖子2d，半开盖子2d，全开盖2d；炼苗完成后，将白术苗从培养瓶移出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后捞出，移栽于盛有松针土的花盆中，浇透水，每天早晚清水喷洒叶面保湿，一周后减少喷水次数；一个月后，统计成活率可以达到92%以上。