[发明专利]一种以花梗为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法

说明书

技术领域

本发明是关于植物快速繁殖技术领域，特别涉及一种以花梗为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法。

背景技术

百合胚性愈伤组织再生体系相比其他再生体系如芽再生体系，具有最高的增殖率和扩繁率，对优良种质的保存有重要意义。此外，百合胚性愈伤组织再生体系也是百合遗传转化体系的决定性基础，进而影响百合的基因工程改良。

目前建立百合愈伤再生体系多以田间鳞茎的鳞片为外植体，其缺陷是鳞茎由于长期处于土壤环境中，携带病菌多，使组织培养消毒要求严格，污染率较高。此外，当需要建立野生百合种质的实验室离体体系时，以鳞茎为外植体，只能采用花期后挖取种球，其突出的不足有二：首先，野生百合位置的确定和种类的辨认很大程度是依靠醒目的花器官及其特征，花期后野生百合地上部分已全部或部分枯萎，尤其是花器官的衰败和花被片脱落使其种类难以辨认，易造成种质资源的混淆；其次，挖取种球等同于对野生资源完全的采集，对于珍稀濒危种类更是难以回复的破坏。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种污染率低、愈伤诱导率高、愈伤团块大、愈伤胚性好、再生能力强、增殖率高，且对种质资源的破坏小的建立百合胚性愈伤再生体系的方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种以花梗为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法，包括以下步骤：

步骤一：材料采取：

在百合花期，取百合长0.5～2.0cm的（幼嫩）花蕾，花蕾带长1～1.5cm的花梗，置于封口袋中在4摄氏度的冰箱中冷藏1周后，再进行后续操作；

步骤二：愈伤诱导培养基配置：

愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.25～1.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)，愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8；

将配置好的愈伤诱导培养基溶液灭菌后，在超净工作台上进行分装，即将愈伤诱导培养基溶液倒入（玻璃或塑料）培养皿中，待愈伤诱导培养基溶液凝固成愈伤诱导培养基后，用保鲜膜或锡纸将至少一个盛有愈伤诱导培养基的培养皿包裹好，放在无菌洁净环境（如组培室）下存放；

步骤三：外植体接种及愈伤组织诱导：

将步骤一中处理后的花蕾，在添加了洗涤精的自来水中浸泡5～30min，再在流水下冲洗0.5～2h清洗干净，然后在超净工作台上进行消毒接种；

消毒方法如下：用添加了0.1%v/v吐温的1%w/v的次氯酸钠溶液，将清洗干净的花蕾进行表面消毒8～15min，然后用无菌水冲洗3遍；

消毒后进行接种：用镊子和解剖刀将花蕾上的花梗切下，将长1cm的花梗接种于步骤二中制作的盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，花梗需先切掉其端部褐化部分产生新鲜切口，然后用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后接种，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、黑暗条件下培养8～40天，完成愈伤组织的诱导，出现愈伤组织团块；

步骤四：小植株再生：

外植体在愈伤诱导培养基上培养40～70天后，开始分化再生出小植株，然后将外植体转接到新鲜的愈伤诱导培养基上，在照度为1800lux、12h光照/12h黑暗的光照条件下，培养90～120天后，在超净工作台上将小植株从愈伤组织团块上分离下来，转入继代培养基培养；

小植株在继代培养基上生长4周后（平均直径达到1cm以上），可进行步骤六中的出瓶种植，或者不出瓶，进行步骤五中的继代以维持百合离体鳞茎再生体系，再进行步骤六中的出瓶种植；

所述继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基中添加有4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、4～8g/L琼脂、0～0.2mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0～0.2mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid,NAA），继代培养基的pH值为5.8；（α-萘乙酸不是必需的，但一定浓度的萘乙酸将有利于小植株根系生长，6-苄氨基腺嘌呤不是必需的，但一定浓度的6-苄氨基腺嘌呤将有利于小植株增殖）