[发明专利]中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)及其编码基因和应用。

背景技术

中华大蟾蜍为无尾两栖类蟾蜍属动物，广泛分布于我国大部分地区，是传统中药蟾酥和蟾皮的主要基源动物，有具有解毒散结、消积利水、杀虫消疳的功效。从中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮提取精制而成的水溶性制剂-华蟾素，目前广泛应用于多种中晚期肿瘤，如原发性肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等。

抗菌肽（Cathelicidin）是主要在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽，因在表达的信号肽与成熟肽间含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族，成熟抗菌肽位于前体分子的C-末端，具有很高的变异性。Cathelicidin和防御素一样，也是宿主免疫防御系统的重要组成部分，具有广谱的抗微生物活性、结合内毒素、抗肿瘤、免疫调节、参与伤口的愈合和血管的发生等多种功能。

发明内容

本发明的目的是提供了一种中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)及其编码基因和应用。中华大蟾蜍的cathelicidin抗菌肽BG-CATH6(29)具有显著的抑制肿瘤细胞的作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。可以应用于抗肿瘤细胞制剂的制备，用于人和动物的治疗。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

所述抗菌肽BG-CATH6(29)含有一对二硫键，由Cys13与Cys19形成。

含有所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)的蛋白前体，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)的蛋白前体的编码基因，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

使用T7启动子序列和SP6启动子序列筛选获得所述编码基因，

所述T7启动子序列为5’-TAATACGACTCTATAGGGA-3’；

所述SP6启动子序列5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’。

本发明还提供了所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。

所述抗菌肽BG-CATH6(29)在100μg/ml时，对肝癌肿瘤细胞的抑制效果显著。

所述抗菌肽BG-CATH6(29)在3.125μg/ml时，对乳腺癌细的抑制效果显著。

所述抗菌肽BG-CATH6(29)在3.125μg/ml时，对脑神经瘤细胞的抑制效果显著。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明在中华大蟾蜍毒液腺cDNA文库中获得了cathelicidin抗菌肽BG-CATH6(29)。其信号肽及cathelin肽段与其它cathelicidin家族的成员高度保守，而其成熟肽高度变异。中华大蟾蜍cathelicidin抗菌肽显示了广谱的抑制肿瘤细胞活性。将本发明的中华大蟾蜍的cathelicidin抗菌肽BG-CATH6(29)全序列氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同cathelicidin家族成熟肽。

因此，爬行动物来源的中华大蟾蜍cathelicidin家族抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，且应用范围广泛。该抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点，可以应用于抗微生物感染和抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中华大蟾蜍cathelicidin家族抗菌肽BG-CATH6(29)的cDNA及其蛋白质序列，其中斜体加框序列为推导的中华大蟾蜍cathelicidin家族抗菌肽BG-CATH6(29)的成熟序列。

图2表明本发明抗菌肽BG-CATH6(29)对肝癌细胞HepG2作用。

图3表明本发明抗菌肽BG-CATH6(29)对乳腺癌细胞MCF-7作用。

图4表明本发明抗菌肽BG-CATH6(29)对脑神经瘤细胞Neuro-2a作用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1、中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)的基因克隆

1、总RNA的提取