[发明专利]一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法。 

背景技术

第一起蜡样芽孢杆菌食物中毒早在1906年就有报告。但直至1950年才明确其病因，之后许多国家，特别是北欧、东欧国家也报告了类似的中毒症。1960～1968年间在匈牙利细菌性食物中毒中，蜡样芽孢杆菌为第三个最常见的致病菌，该菌所致食物中毒为已报告食物中毒起数的84％，中毒人数占总中毒人数的14.8%。1971年以来，英国报告过多起该菌食物中毒。我国南京市卫生防疫站于1973年首次报告了南京某托儿所儿童因进食泡饭引起呕吐型蜡样芽孢杆菌食物中毒。现今除西藏外，各省、市已相继报告该菌食物中毒。蜡样芽孢杆菌食物中毒涉及的食品种类多,在我国发生的蜡样芽孢杆菌食物中毒多与米饭或淀粉类制品有关。据调查，食物的带菌率最高可达70%,误食带有大量活菌及其肠毒素的食物后可引起呕吐型或腹泻型肠胃炎，对人类的健康有着极大的危害，为提高食品安全性，建立一种快速灵敏的检测方法十分必要，具有极大的科研及应用价值。目前蜡样芽孢杆菌复溶检测方法主要有 

细菌学检测方法 

传统的细菌学检测主要依据菌落的形态特征和其生理特性，如菌落是否灰白色，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，菌落较大等特征进行甄别、检测。根据这特性设计的一系列试验均可对蜡样芽孢杆菌进行鉴定，无需测试其它生化指标。但是需长时间进行选择性增菌，整个过程耗时较长。。极大限制了在食品加工中对该菌污染的有效监控。 

免疫学检测 

传统的血清学反应如单向/双向扩散技术、间接血凝技术、对流免疫琼脂凝胶泳技术，补体结合试验等虽然操作简便，但是影响因素因素太多，且费时，敏感差。因此，更多新的免疫学检测技术应运而生，包括酶联免疫吸附(ELISA)、疫荧光(Ⅲ)、放射免疫法(RIA)、流式细胞分析(FCM)、免疫电化学发光(IECL)等。这些免疫学检测方法都建立在抗原抗体特异结合的基础上，同时利用荧光，放射性，酶标等显色技术而达到检测目的。这些方法特异性、重复性以及敏感性较好，且结合物高度稳定、有效期长、仪器设备简单，因而广泛应用于实验室研究。而这些方法的基石在获得一株特异性好灵敏度高的腊样芽胞杆菌的抗体，本专利针对此问题建立了一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，为蜡样芽孢杆菌快速高特异性检测方法的建立奠定基础。 

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种高效的蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法。 

技术方案：本发明提供的一种蜡样芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤： 

1)富集：首先将0.5～1ml的-80℃冻存的蜡样芽孢杆菌的菌种加入到20～40ml Luria～Bertani液体培养基中，36～38℃恒温摇床150～250rpm震荡过夜，将蜡样芽孢杆菌的菌种活化，取50～150ul活化好的菌种用涂布法将其均匀涂布在Luria～Bertani固体培养基表面，36～38℃恒温培养箱，培养12～24h，当培养的蜡样芽孢杆菌的菌体数量可以完全覆盖平板时，用2～3ml浓度为0.9%的生理盐水，借助无菌的涂布棒轻轻刮板，避免将培养基刮下，收集洗涤液制备菌液，7000～9000rpm/min高速离心5～10min，弃上清，得到菌富集沉淀，0.9%的生理盐水洗涤沉淀，洗涤次数为3～5次。 

2)固定：指将菌沉淀首先浸润于液氮5～10min，然后快速完全溶解于5ml浓度为0.9%的生理盐水，置于沸水浴变加热边震荡15～20min，使得腊样芽胞杆菌的表面成分固定，抗原决定簇充分暴露，制备得到菌抗原。 

3)乳化：将一定浓度的固定好的蜡样芽孢杆菌的生理盐水悬浮液，分别添加一定剂量的氟氏佐剂及RIBI 佐剂，利用自组装乳化仪自组装乳化仪将混合物处理30～50min得到均匀的乳化液。 

4)免疫：将制备得到的乳化液，以氟氏完全佐剂组注射背部多位点为主，以RIBI佐剂组注射腹股沟、腋窝、脚蹼的外周位点为辅注射1～2月龄，重约2～3Kg雌性新西兰大白兔背部平行的八个位点，免疫注射菌抗原悬浮液的浓度为5×10⁸～10×10⁸cfu/ml，用量为0.5～2ml，每个位点注射200～300ul；腹股沟、腋窝、脚蹼外周位点免疫注射菌抗原悬浮液的浓度为1×10⁸～5×10⁸cfu/ml，用量为0.5～2ml；免疫间隔设置为首次免疫与第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫注射间隔时间为5～9d，2～4d，2～4d，2～4d。