[发明专利]极地雪藻固定化保种方法

说明书

技术领域

本发明属于微藻养殖领域，尤其涉及一种极地雪藻固定化保种方法。

背景技术

雪藻snow algae是生活在两极及相似极端环境中的一类特殊的单细胞微藻类群，已发现有几十种，分属不同门类。大部分分布在雪地几厘米深的表层，冰雪融化时形成雪地藻华snow algal bloom，因细胞富含虾青素而呈深红色，因此又称血雪blood snow。其中极地雪藻Chlamydomonas nivalis是一种淡水单细胞绿藻，在分类学上属于绿藻门Chlorophata、绿藻纲Chlorophyceae、团藻目Volvocales。研究发现，细胞内的虾青素有抗紫外辐射功效。极地雪藻最适生长温度是8-10℃，在营养丰富和低光强下保持绿色并快速生长，而在营养贫乏和高光强等极端环境下细胞生长缓慢并开始大量积累红色类胡萝卜素一虾青素。极地雪藻还具有生产高不饱和脂肪酸的潜在前途，在理想的培养条件下，极地雪藻含有的不饱和脂肪酸占总脂肪酸的80％以上。

在微藻的培养和应用中，保种工作十分重要，它是微藻培养和进一步应用的基础和关键。由于藻种极易受污染，分离和纯化技术较复杂而且耗时较长，因此在微藻保种中要尽量减少接种次数，避免藻种被杂藻、细菌或原生动物污染。传统的保种方法是用褐藻酸钠或琼脂作为主要固定剂，接种后的固体培养基置于温度为3-6℃，光照强度为1000-1500lx的条件下保存。该方法存在很多缺点：保种时间短，为1-2年，营养盐消耗快，培养基易老化，需频繁更换培养基，工作量大，细胞存活率低，仅为37％左右，易因污染而导致保种失败。

本发明是用蛋白胨代替传统的褐藻酸钠或琼脂作为主要固定剂，而且在培养基中增加了碳酸氢钠、柠檬酸铁、山梨酸钾、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液、络合剂乙二胺四乙酸等营养成分，营养更加全面并添加了乙二醇作为抗冻剂，接种后的培养基置于温度为-50±2℃、光照强度200-400lx的低温、弱光培养箱中保存。采用本方法保存极地雪藻能显著提高藻细胞的存活率，存活率由原来的37％提高到了94％，大大降低了工作量，不易污染，种质纯正，大大延长保种时间，长达6-8年而且保种成本降为原来的1/3。

发明内容

为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种极地雪藻固定化保种方法，方法如下：

一种极地雪藻固定化保种所用软蛋白胨固体培养基，配方如下：

A溶液：NH₄NO₃40毫克，NaNO₃5毫克，尿素5毫克，KH₂PO₄1.8毫克，Na₂SiO₃8毫克，NaHCO₃500毫克，九二0植物生长刺激素8国际单位，山梨酸钾10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，环己基氨基磺酸钠20毫克，蜂胶9毫克，麦芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸钠8毫克，焦磷酸铁4毫克，柠檬酸钾6毫克，乙酸钠5毫克，山梨糖醇液1毫升，三聚甘油单硬脂酸酯10毫克，人尿1毫升，海泥抽取液1毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸纯净淡水1000毫升；

B溶液：即f/2微量元素溶液：ZnSO₄·4H₂O23毫克，MnCl₂·4H₂O178毫克，CuSO₄·5H₂O10毫克，FeC₆H₅O₇·5H₂O3.9克，Na₂MoO₄·2H₂O7.3毫克，CoCl₂·6H₂O12毫克，Na₂EDTA4.35克，蒸馏水1000毫升；

将上述A、B溶液煮沸消毒后，装入高压灭菌过的棕色试剂瓶中置于4℃冰箱低温保存；C溶液配制完后装入高压灭菌过的棕色试剂瓶，置于4℃低温冰箱备用；