[发明专利]一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学领域，特别涉及一种链霉菌体内调控蛋白对特定DNA片段结合的体外筛选方法。 

背景技术

许多蛋白质在生物体内具有调控作用，其中一类为激素，如动物体内的胰岛素，其可以调控动物体内的血糖浓度等。还有一类调控蛋白可以参与基因的表达的调控，它们可以激活或者抑制特定基因的转录水平。 

链霉菌属于放线菌属，是革兰氏阳性细菌。链霉菌具有复杂的生命周期，包括从基质菌丝、气生菌丝到孢子的形态分化。目前使用的大部分抗生素是由链霉菌生产的。在链霉菌生命周期的不同阶段，其体内的调控蛋白通过激活或者抑制相关基因的转录水平，调控这些生命周期平稳有序地进行。同时调控基因还能调节链霉菌体内各种代谢相关基因和抗逆基因的表达水平，以调控多种次级代谢产物的产生和对多种环境胁迫的适应等。因此对于链霉菌体内生长与代谢调控蛋白的研究不论是从基础科研还是从工业生产上来说，都具有极其重要的意义。 

以链霉菌中的模式生物天蓝色链霉菌为例，全基因组测序表明，其基因大小为8.6Mbp，共7825个基因，其中包含了数量庞大的调控基因。由此可知，各种调控基因在天蓝色链霉菌的生长代谢过程中形成了一个复杂的调控网络，精密调节着链霉菌的生长发育。其调控网络的复杂性也大大增加了研究人员对其调控机制研究的难度。因此我们急需各种高效的调控基因筛选、定位等研究方法。 

发明内容

本发明的目的是针对链霉菌体内调控蛋白研究，提供一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法，是一种调控蛋白体外筛选的新技术。 

本发明将链霉菌生物体破胞，得到链霉菌蛋白质组溶液。同时将有生物素标记的目的DNA片段与链亲和素琼脂糖相结合后，再与蛋白质组溶液相互混合，筛选得到链霉菌中与目的DNA片段相互结合的蛋白质溶液。最后，使用高效液相色谱以及串联质谱的方法对结合蛋白进行部分氨基酸残基测序，精确确定与目的DNA片段相结合的每一种蛋白分子。具体步骤如下： 

（1）将链霉菌液体培养基培养24～48小时后，以5000rpm速度离心5分钟，用蛋白结合液重悬成悬液，将悬液超声破碎后，于4℃条件下12000rpm速度离心10分钟，取上清，并用直径0.45um的微孔滤膜过滤上清，得到蛋白质组溶液备用；

（2）制备生物素标记的载体片段DNA和生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA；

（3）将链亲和素琼脂糖与生物素标记的载体片段DNA在蛋白结合液中混合，置于亲和层析柱中，于25℃摇动结合30分钟后，弃去上清；

（4）将蛋白质组溶液加入（3）中的亲和层析柱中，25℃摇动结合30分钟后，过滤取上清；

（5）将链亲和素琼脂糖和生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA在蛋白结合液中混合，置于亲和层析柱中，于25℃摇动结合30分钟后，弃去上清；

（6）将（4）中得到蛋白质组溶液加入（5）中的亲和层析柱中，25℃摇动，与有生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA的链亲和素磁珠结合30分钟后，过滤弃上清；

（7）使用蛋白结合液将（6）中的亲和层析柱过滤洗涤两遍后，加入蛋白洗脱液。将亲和层析柱于25℃摇动洗脱30分钟，过滤收集上清溶液；

（8）使用10kD超滤离心管将7）中得到的上清溶液替换成NH₄HCO₃溶液；

（9）将（8）中得到的溶液加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇，于56℃保温30分钟后冷却到室温。接着加入终浓度为20mM的碘乙酰胺，于黑暗下25℃保温30分钟。接着加入胰蛋白酶，37℃保温5个小时，60℃烘干；

（10）将得到的干粉样品在串联质谱中进行氨基酸残基测序分析；

（11）将得到的氨基酸残基序列在链霉菌的全基因组数据库中进行序列比对，精确确定和目的DNA序列相结合的蛋白，及其对应的基因，并筛选出其中可能的调控基因；

（12）体外表达并纯化筛选出的可能的调控蛋白，使用EMSA（凝胶电泳迁移率实验）实验进一步验证该蛋白与目的DNA相互结合的实验事实。

蛋白结合液配方为：终浓度为10%甘油、20mM Tris·Cl，50mM NaCl、1mM EDTA，溶液最终pH值为8.0。 

蛋白洗脱液配方为：终浓度为10%甘油，20mM Tris·Cl、1M NaCl、1mM EDTA，溶液最终pH值为6.8。