[发明专利]一种太平洋牡蛎胚胎超低温冷冻保存方法

说明书

技术领域

本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种太平洋牡蛎胚胎超低温冷冻保存方法，把太平洋牡蛎胚胎经过抗冻保护剂处理、降温冷冻、置于液氮中长期保存及复温培育的过程。

背景技术

太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)属于牡蛎科，巨蛎属，俗称真牡蛎，其个体较大，在我国主要分布于山东及辽宁地区，其肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，尤其蛋白质、脂肪、肝糖、碘、维生素等营养物质含量丰富，有海洋牛奶之美称。20世纪80年代从日本、澳洲和台湾地区引入我国，在我国养殖十分广泛，目前已经成为我国最重要的养殖贝类，具有极高商业开发价值的海洋经济动物。近年来，由于养殖规模的不断扩大，对太平洋牡蛎种质需求也不断扩大，然而近几年来，由于累代养殖、近亲交配造成了种质退化、杂合度降低等一系列问题，致使太平洋牡蛎的生长速度与引进初期相比明显下降，养成周期不断延长。因此，选育具有优良生长性状的太平洋牡蛎品系、建立太平洋牡蛎的胚胎冷冻技术成为太平洋牡蛎养殖的当务之急。太平洋牡蛎胚胎的超低温保存在水产养殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义：太平洋牡蛎胚胎的超低温保存对于太平洋牡蛎这种海水名贵贝类的种质保存、遗传多样性和育种、可持续养殖、种质的长距离运输、贝类品的选育以及基因多样性的保护等方面有着重要意义

发明内容

本发明的目的在于提供一种太平洋牡蛎胚胎超低温冷冻保存方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

从养殖场购得太平洋牡蛎，解剖取的精液和卵子，经人工授精获得太平洋牡蛎担轮幼虫期胚胎，加入抗冻保护剂，预冷后装入0.5ml或者0.25ml的麦管中进行分步降温，-40℃前采用两步慢速降温，-40℃后采用快速降温至-180℃后直接投入液氮中保存28℃水浴解冻复温培育，采用计算机辅助分析（CASA）检测太平洋牡蛎胚胎的运动率。所述太平洋牡蛎胚胎为担轮幼虫期胚胎，人工受精后于19±1℃温度条件下培养12-14h后发育至担轮幼虫期，用于胚胎冷冻保存。

所述冷冻保存的太平洋牡蛎担轮幼虫期胚胎，是经200目筛绢过滤浓缩获得。

所述抗冻保护剂为10%DMSO（V/V，DMSO体积/太平洋牡蛎胚胎体积），太平洋牡蛎胚胎中提前添加有0.2M的海藻糖溶解混匀。

所述太平洋牡蛎担轮幼虫加入海藻糖和抗冻保护剂后充分混匀，在0～4℃冰箱中预冷30分钟。

所述混合有0.2M海藻糖和10%DMSO（V/V，DMSO体积/太平洋牡蛎胚胎体积）太平洋牡蛎胚胎预冷后加入到0.5ml或者0.25ml的麦管中，用封口粉封口后放入程序降温仪进行程序降温。

所述两步慢速降温是指0～-15℃降温速率为-1℃/分钟，-15～-40℃降温速率为-3℃/分钟，并且在-15℃停留3分钟，以便其充分形成冰核。所述快速降温是指-40～-180℃降温速率为-20℃/分钟，降至-180℃后取出，立即投入液氮中长期保存。

所述保存后的太平洋牡蛎担轮幼虫解冻时，用镊子从液氮中取出装有太平洋牡蛎担轮幼虫期胚胎的麦管，放入28℃水浴轻轻摇晃解冻至麦管开始呈现透明状态后取出，室温放至完全融化，剪刀剪开麦管两端放入海水中培育，获取复活胚胎。

所述培育胚胎的海水，是将海水经煮沸消毒后，按海水体积计加有5%BSA。

本发明具有如下优点：

1.本发明采用200目筛绢过滤浓缩太平洋牡蛎胚胎，保存胚胎量大；

2.本发明冷冻保存担轮幼虫期太平洋牡蛎的胚胎，抗冻能力强，解冻后活力高；

3.本发明采用0.25和0.5ml麦管装太平洋牡蛎胚胎，温度控制更加精密；

4.本发明采用10%（v/v）二甲亚砜（DMSO）为抗冻保护剂，保持较好渗透性的同时又降低了毒性；

5.本发明抗冻液中加入了0.2M海藻糖作为添加剂，通过其非渗透性保护作用对胚胎的质膜起到很好的保护作用；

6.本发明降温前太平洋牡蛎担轮幼虫与抗冻液混匀，4℃冰箱中预冷30分钟，既能保证抗冻保护剂充分渗入到太平洋牡蛎胚胎内部，又不会因抗冻保护剂本身的毒性作用对胚胎造成过大的损害；

7.本发明慢速降温时，首先采用以-1℃/min速度降温，降至-15℃后平衡3分钟，以便太平洋牡蛎胚胎内部形成冰核，又以-3℃/min降至-40℃，使冷冻胚胎安全度过“危险温度区”节省了时间，操作简便易行；

8.本发明采用-20℃/min的降温速率快速进入稳定状态-180℃，然后投入液氮，整个降温过程时间短，实用性强；