[发明专利]用于捕获生物活性剂的细胞标靶的组合物和方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年12月12日提交的序号为61/736,426的美 国临时专利申请；以及于2013年9月19日提交的序号为61/883,313 的美国临时专利申请的优先权；这两篇文献通过引入整体并入本文。

领域

本发明提供了用于捕获和鉴定生物活性剂的细胞标靶的组合物 和方法。特别地，本文提供了束缚至捕获配体、细胞标靶(内源的或 者任选用报告分子标记的)、捕获蛋白(任选作为捕获融合体存在)、表 面(例如，展示捕获配体、捕获蛋白或捕获融合体)的生物活性剂，以 及以此来捕获和鉴定生物活性剂的细胞标靶的方法。

背景

细胞基表型筛选正越来越多地用于发现生物活性药物候选物。药 物候选物的标靶在细胞环境内天然地运行，并且它们如何与生物活性 分子(例如，合成分子)相互作用受到该环境的显著影响。为此，当试 图鉴定生物活性分子的未知标靶时，优选在捕获用于鉴定前使该标靶 结合至活细胞内的生物活性分子。因此，在捕获前使结合发生于细胞 裂解物中的方法不是优选的。对于介导期望的生物活性的初级标靶而 言以及对于可导致倾向性或干扰的脱靶而言，情况确实如此。发现并 验证这样的生物活性分子的蛋白标靶常常使用亲和富集与质谱法的 组合。这样的方法面临一些挑战。首先，靶分子与蛋白标靶之间经常 的中度结合至弱结合使其难以捕获靶蛋白或靶蛋白复合物，使结果偏 向高亲和相互作用子。此外，亲和富集法通常使用固定有候选靶分子 的固体载体。当与溶液基动力学比较时，固体表面上的结合动力学慢 得多，进一步减少了捕获靶蛋白或靶蛋白复合物的机会。来自细胞裂 解物的蛋白与固体载体的非特异性结合导致高背景，这进一步复杂化 使用质谱(MS)鉴定细胞标靶。这样的方法常常导致大量的推定命中， 使其必须进行二次筛选来验证潜在的标靶。还需要开发和优化用于靶 分子-蛋白相互作用的高通量验证测定，使其成为资源密集型方法。

概述

在一些实施方案中，本发明提供了组合物和系统(例如，细胞、 反应混合物、试剂盒、容器等)，其包含以下中的一种或多种(例如， 所有)：(a)生物活性剂的细胞标靶；(b)第一捕获蛋白和第二捕获蛋白 的融合体；(c)束缚至第一捕获配体的所述生物活性剂，其中所述第一 捕获配体与所述第一捕获蛋白基于其相互作用形成共价键；以及(d) 展示第二捕获配体的固体表面，其中所述第二捕获配体与所述第二捕 获蛋白基于其相互作用形成共价键。在一些实施方案中，(a)包括生物 活性化合物的多种细胞标靶。在一些实施方案中，所述细胞标靶在细 胞内表达为与报告分子的融合体。在一些实施方案中，所述报告分子 是生物发光报告分子。在一些实施方案中，所述报告分子是生物发光 蛋白的部分、组分或亚基。在一些实施方案中，所述生物发光报告分 子包含与SEQ ID NO.：3具有至少70％(例如，75％、80％、85％、90％、 95％、98％、99％)序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述第一 捕获蛋白和第二捕获蛋白二者都包含与SEQ ID NO.：1的至少 70％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％)序列同一性。 在一些实施方案中，所述融合体是同二聚物。在一些实施方案中，所 述生物活性剂是小分子。在一些实施方案中，所述细胞标靶是所述生 物活性剂的结合配偶体。在一些实施方案中，所述细胞标靶包括分子 组合，例如，两个或更多个蛋白的复合物，或者蛋白与核酸的复合物。 在一些实施方案中，所述第一捕获配体和第二捕获配体包含相同的分 子结构。在一些实施方案中，所述固体表面选自由以下组成的清单： 孔、管、载片、板、基质、树脂、微流通道、毛细管、珠、颗粒(例 如，微粒、纳米颗粒等)等。在一些实施方案中，固体表面是磁性的。 在一些实施方案中，固体表面是非磁性的。在一些实施方案中，所述 细胞标靶结合至所述生物活性剂，所述第一捕获蛋白结合至所述第一 捕获配体，并且所述第二捕获蛋白结合至所述固体表面上的所述第二 捕获配体。