[发明专利]用荧光监测温度

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年10月9日提交的美国临时专利申请号61/711,631的优先权和权益，该申请整体通过引用合并于本文。

背景技术

聚合酶链反应(“PCR”)是分子生物学中广泛使用的技术。它们的名称源自关键组分之一，即通过酶促复制扩增DNA链的DNA聚合酶。通常，PCR使用耐热的聚合酶、脱氧核苷三磷酸(“dNTP”)、一对引物和模板DNA。单个PCR反应(或循环)通常包括(1)提高样本的温度至足以将双链DNA分子熔解或变性成单链模板的温度，(2)冷却样本，让DNA引物结合或退火到每条模板，以及任选地(3)重新调节样本温度，以优化向每条被结合引物的末端酶促添加dNTP，形成新的DNA分子。随着PCR进行，产生的DNA(“扩增子”)自身用作模板用于进一步的复制。这启动了DNA模板以指数扩增的链式反应。使用PCR，可能在多个数量级范围内扩增单拷贝的DNA或较少拷贝的DNA，产生数百万或更多的DNA拷贝。

有效的PCR依赖于在热循环中准确且可重复地获得产物/模板的变性(或熔解)温度和引物退火温度。这反过来依赖于准确测量和控制样本和/或溶液的温度。PCR样本温度的测量和控制可手动进行或通过自动化仪器，例如热循环仪(或温度循环器)进行。许多热循环仪中的温度传感器测量含有扩增溶液的PCR管周围的金属模块或隔室的温度。使用这种“外部”温度传感器，有时可在温度保持恒定的平衡过程中获得准确的测量。然而，在温度转变过程中，溶液的温度经常滞后于仪器模块或隔室的温度，可能导致对温度监控和控制的不准确和不一致——该影响在PCR循环速度提高时变得更明显。

PCR溶液内的直接传感器接触虽然可能比外部温度测量更准确，但也存在问题。这种PCR的直接、内部测定由于产物污染、PCR抑制、传感器热质增加以及光学测量的障碍而通常不被赞成。这些担忧中的许多随着样本体积减小而愈发严峻。然而，在较大的样本中，直接的物理传感器仅测量一个位置的温度，而这可能不能准确地反映整个溶液的温度。

随着时间，PCR的温度循环变得更快。在更快的速度时，大部分循环时间花费在温度转变中，并且溶液温度很少追随所测量的仪器温度。改善对快速PCR循环中溶液温度的测定的尝试包括依赖于样本体积的预测算法，以及具有与样本相同的热响应使得它们在动力学上相匹配的传感器。然而，由于PCR中的生化反应快速，并且有许多迅速改变样本(尤其是小样本)温度的方式，限制PCR一致性(特别是在快速时)的因素似乎是准确的温度测量。

发明概述

本发明包括使用发光(luminescence)监测样本的内部状态。本文描述的本发明的一个或多个实施方式包括使用条件敏感性试剂的一个或多个内在发光特性准确地监测样本的状况。某些实施方式包括，例如使用pH敏感性试剂和/或温度敏感性试剂的内在发光在PCR热循环和/或准确度提高的仪器校准过程中监测样本温度的方法和系统。在至少一个实施方式中，温度敏感试剂的内在荧光作为温度的函数以已知和/或可预测的方式而变化。因此，某些实施方式包括使用样本荧光作为内部温度的监测物，以反映整个样本的平均温度或控制热循环。

在一个实施方式中，描述了包含至少一种条件敏感性试剂的PCR混合物。所述PCR混合物可包含进行PCR所需要的一种或多种试剂(例如，至少一个核酸模板、包括经设计退火到所述至少一个模板核酸的至少一部分上的至少一个正向引物和一个反向引物的多个核酸引物、热稳定性聚合酶、dNTP等)以及条件敏感性试剂。在一个实施方式中，所述条件敏感性试剂可包括至少一种能响应于刺激而发出依赖于温度的发光信号的温度敏感性试剂。在至少一个实施方式中，所述至少一种温度敏感性试剂发出的发光信号具有在95℃和50℃之间改变至少50％的荧光信号。例如，所述至少一种温度敏感性试剂可显示约1％/℃的温度敏感度。在至少一个实施方式中，由所述温度敏感性试剂发出的发光信号的量不与样本中存在的核酸的量成正比。例如，优选所述温度敏感性试剂不是结合dsDNA的染料，所述温度敏感性试剂的发光信号不受dsDNA变性(或熔解)的影响，并且/或者所述温度敏感性试剂未结合至核酸。

在另一个实施方式中，描述了测量样本温度的方法。所述方法可包括(1)提供待测量的样本，所述样本包含已知量的响应于刺激而发出发光信号的温度敏感性试剂，其中，所述温度敏感性试剂发出的发光信号的量作为温度的函数以已知且可预测的方式而变化。所述方法进一步包括(2)测量所述温度敏感性试剂发出的发光信号的量；以及(3)确定作为所述温度敏感性试剂发出的发光信号的函数的样本温度。