[发明专利]CRZ1突变型真菌细胞

说明书

本发明提供了CRZ1突变型真菌宿主细胞，例如巴斯德毕赤酵母。突变型真菌宿主细胞显示出温度抗性、增强的发酵稳健性和增加的异源多肽(例如免疫球蛋白)的表达。使用此类突变型真菌宿主细胞，生产异源多肽(例如免疫球蛋白)的方法在本发明的范围内。

本申请要求于2012年10月22日提交的美国临时专利申请号61/716,670的利益；所述美国临时专利申请整体通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及CRZ1突变体等位基因和包含此类等位基因的真菌宿主细胞，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，连同其使用方法。

发明背景

GlycoFi已将毕赤酵母工程化以产生具有人样糖基化的重组糖蛋白。然而，广泛遗传修饰也已引起细胞壁结构中的根本变化，使这些经糖工程化的菌株倾向于细胞裂解且降低发酵期间的细胞稳健性。这些不希望的性状已导致细胞活力的大幅降低以及细胞内蛋白酶泄露到发酵液内的显著增加，导致重组产物得率和质量两者的降低。已知缺乏功能性OCH1 (真菌糖基化途径中的多肽)的分离的真菌宿主细胞，例如白色假丝酵母(Candida albicans)；多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；巴斯德毕赤酵母，是温度敏感的。例如，白色假丝酵母och1敲除型在42℃下是温度敏感的(Bates等人，Outer Chain N-Glycans AreRequired for Cell Wall Integrity and Virulence of Candida albicans，TheJournal of Biological Chemistry 281: 90-98(2006)；多形汉逊酵母och1敲除型在45℃下是温度敏感的(Kim等人，Functional Characterization of the Hansenulapolymorpha HOC1，OCH1，and OCR1 Genes as Members of the Yeast OCH1Mannosyltransferase Family Involved in Protein Glycosylation，The Journal ofBiological Chemistry，281: 6261-6272(2006))；粟酒裂殖酵母och1敲除型在37℃下是温度敏感的(Yoko-o等人，Schizosaccharomyces pombe och1⁺ encodes alpha-1,6-mannosyltransferase that is involved in outer chain elongation of N-linkedoligosaccharides，FEBS Letters 489: 75-80(2001))；酿酒酵母och1敲除型在37℃下是温度敏感的(Nakayama等人，OCH1 encodes a novel membrane boundmannosyltransferase: outer chain elongation of asparagine-linkedoligosaccharides，EMBO J. 11(7):2511-9(1992))；并且巴斯德毕赤酵母och1敲除型在37℃下是温度敏感的(Choi等人，Use of combinatorial genetic libraries to humanizeN-linked glycosylation in the yeast Pichia pastoris，Proc Natl Acad Sci U S A.100(9):5022-7(2003))。制备在细胞培养中更稳健的och1^-真菌宿主细胞(例如毕赤酵母细胞)的另外遗传修饰是有价值的。