[发明专利]使用改良的肠杆菌科菌株发酵产生L-氨基酸的方法

说明书

本发明涉及使用具有弱化的proP基因的肠杆菌科微生物发酵生产L‑氨基酸的方法，适于所述生产的微生物及编码ProP转运蛋白变体的多核苷酸。

本发明涉及使用具有弱化的proP基因的肠杆菌科微生物发酵产生L-氨基酸的方法，适于所述生产的微生物及编码ProP转运蛋白的变体的多核苷酸。

有机化合物，特别是含硫L-氨基酸具有重大的经济学意义。L-半胱氨酸用作食品补充剂，用作药物学活性化合物(例如N-乙酰半胱氨酸)及化妆品的起始物。氨基酸L-甲硫氨酸在动物营养中起重要作用，是在脊椎动物代谢中不能生物合成产生的必需氨基酸之一。因此，在动物饲养中，必须保证随着饲料摄取足够量的特定氨基酸。然而，由于L-甲硫氨酸通常以太低的量存在于常规饲料植物(如大豆或谷物)中，不能保证最佳的动物营养，特别是对于猪和家禽，有利的是掺入甲硫氨酸作为动物饲料的添加物。脊椎动物可以将D-甲硫氨酸转变为生物活性L-甲硫氨酸。因此，通常将D-和L-甲硫氨酸的外消旋体加入动物饲料中。动物通过转甲基作用可以将L-高半胱氨酸转变为L-甲硫氨酸，前者因此可代替后者。

下文提及的有机化合物是指选自L-氨基酸，优选含硫L-氨基酸，特别是L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的一或多种化合物。优选L-甲硫氨酸。

在现有技术中，氨基酸如甲硫氨酸是通过化学合成制备的。这包括首先使丙烯醛与甲硫醇反应产生3-(甲硫基)丙醛，其依次与氰化物、氨和一氧化碳产生乙内酰脲。最终，后者可以水解为外消旋体，两种立体异构体D-和L-甲硫氨酸的等摩尔混合物。由于分子的生物活性形式仅呈现为L形式，因此饲料中存在的D形式必须首先通过脱氨和转氨作用经代谢地转变为活性L形式。

与甲硫氨酸不同，大多数其它天然的蛋白原性氨基酸如L-苏氨酸是通过微生物发酵鉴定制备的。这是利用微生物具有合适的合成天然氨基酸的生物合成途径。此外，许多发酵方法通过使用廉价的反应物如葡萄糖和无机盐实现非常有利的生产成本，并且也实现特定氨基酸的生物活性L形式。

已知有机化合物可以通过肠杆菌科，特别是大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏菌的菌株发酵而产生。由于其显著性，不断进行尝试以改良制备方法。生产方法的改良可涉及发酵技术，例如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间使用的糖的选择及糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。

野生型菌株中氨基酸的生物合成途径受到严格代谢控制，以保证氨基酸仅为细胞固有的需要而生产。因此，对于有效的生产方法的一个重要先决条件是用于制备希望的氨基酸的合适的微生物的可利用性，与野生型生物体不同，所述合适的微生物具有大幅度增加的生产产量、超过固有需要(过量生产)。

这种过量产生氨基酸的微生物可以通过传统的突变/选择方法和/或通过现代的特定的重组技术(代谢工程)产生。后者包括首先鉴定由于其修饰、激活或失活而影响氨基酸过量产生的基因或等位基因。然后将这些基因/等位基因导入微生物菌株中或者使用分子生物学技术使其失活以实现最佳的过量生产。然而，通常只有组合多个不同的措施才能导致真正有效的生产。

L-甲硫氨酸与赖氨酸和苏氨酸都衍生自天冬氨酸。将硫以L-半胱氨酸形式(通过胱硫醚作为中间物)通过转硫化导入L-甲硫氨酸中。L-甲硫氨酸的CH₃基团源自C1代谢并由MetE或MetH甲硫氨酸合酶转移至L-高半胱氨酸(参见：Greene RC(1996)in Neidhardt FCet al.(eds.)“Escherichia coli and Salmonella”,2^nd edition,pp.542-560)。例如，发酵生产L-甲硫氨酸的菌株和方法已经在WO2006/001616或WO2009/043803中有对于大肠杆菌的描述。