[发明专利]用于检测癌症干细胞的EpCAM适配子

说明书

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技术领域

本公开涉及RNA适配子及其应用，具体而言，涉及特异性结合EpCAM并显示优良肿瘤渗透能力的适配子。

发明背景

上皮细胞粘附分子EpCAM(也称为CD326或ESA)为多效分子，能够促进和防止上皮细胞-细胞粘附。它是以低水平在多种人上皮组织中表达的30-40kDa I型糖基化膜蛋白。EpCAM在大多数实体癌症中过表达。例如，在多于98％的患有结肠直肠癌的患者中发现了EpCAM的密集表达。二十年的研究已阐明了EpCAM在肿瘤发生中的作用。EpCAM不是拮抗细胞凋亡，而是通过诱导增殖起作用，其对上调原癌基因c-myc及细胞周期素A和E的细胞周期调控，以及通过Wnt通路进入细胞核的信号转导具有直接影响。

最近发现小部分的癌细胞具有无限的增殖潜力，并能够自我更新和生成分化的癌细胞后代。这些所谓的癌症干细胞(CSC)耐受化疗和放疗。据认为细胞毒性药物和辐射主要杀伤大肿瘤细胞，但不杀伤癌症干细胞。因此，为了有效根除癌症，必须靶向和清除癌症干细胞以及它们的后代细胞。

上皮细胞粘附分子已被确定为多种实体癌症的癌症干细胞标志物，包括乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌和肝癌。EpCAM在多种癌症中的表达似乎与患者的预后负相关(Baeuerle PA et al(2007).Br J Cancer96:417-23)。使用抗EpCAM抗体的初始临床试验未能提供客观的临床反应。据认为大体积的抗体限制了单克隆抗体的分布和递送。另外，依赖于抗体的细胞毒性依赖于抗体的CH2中的糖类组分，其在抗体制备期间可显著改变。因此，需要较小的和更有效的EpCAM靶向分子用于靶向性癌症治疗。

发明概述

考虑到当前的抗EpCAM抗体治疗的不同成功，发明人试图开发出靶向EpCAM癌症干细胞标志物的耐核酸酶RNA适配子。因为适配子比抗体小10-20倍，它们具有极好的组织渗透特性，并因此在癌症靶向上优于抗体。虽然适配子显示出良好的前景，但将它们用作用于免疫组织化学的探针的报道有限。虽然不希望受到理论的束缚，由于这些多聚阴离子核酸适配子与带正电荷的位点如核中存在的组蛋白的静电引力，已提出在组织学方案中与用适配子替换抗体相关的一项困难可能来自它们的非特异性染色。

本公开描述了具有诊断和治疗潜力的针对EpCAM的RNA适配子。

本公开提供了分离的RNA适配子，其特异性结合EpCAM，其中所述适配子不是具有序列5’–GCGACUGGUUACCCGGUCG-3’(SEQ ID NO:1)的DT3。

本公开提供了分离的RNA适配子，其特异性结合EpCAM，所述适配子包含序列5’–ACGUAUCCCUUUUCGCGUA-3’(SEQ ID NO:2)。在一个实例中，所述EpCAM为人EpCAM。

在一个实例中，本公开的适配子具有针对表达于乳腺肿瘤细胞系上的EpCAM的约90nM或更小的解离常数。在另一个实例中，解离常数为约65nM或更小。在另一个实例中，解离常数为约45nM或更小。在另一个实例中，针对MDA-MB-231细胞的解离常数为约87nM。在另一个实例中，针对MCF7细胞的解离常数为约64nM。在另一个实例中，针对T47D细胞的解离常数为约41nM。

在另一个实例中，本公开的适配子针对表达于结肠癌细胞系(HT29细胞)上的EpCAM具有约37nM的解离常数。

在另一个实例中，分离的RNA适配子基本上由SEQ ID NO:2所示的序列组成。

在另一个实例中，分离的RNA适配子由SEQ ID NO:2所示的序列组成。

在另一个实例中，分离的RNA适配子包含SEQ ID NO:2所示的序列，其中序列长度为19-100个碱基。在另一个实例中，序列长度为19-40个碱基。在另一个实例中，序列长度为19-30个碱基。在另一个实例中，序列长度为19-25个碱基。如本文所用的术语“碱基”应理解为是指核苷酸碱基或残基，其为鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)。所述碱基可在胞嘧啶和鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶以及鸟嘌呤和尿嘧啶之间形成氢键。