[发明专利]多量级光谱纳米显微镜

说明书

本发明的政府权利

基于由能源部所授予的授权号DE-SC0006838，在政府的支持下创作本发明。政府拥有本发明的特定权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年7月18日提交的美国临时申请61/672,837和于2013年3月5日提交的美国临时申请61/772,617的优先权，将其全部内容结合于本文中。

技术领域

本发明总体上涉及用于追踪单个粒子的系统和方法，更具体地，涉及用于使单个粒子成像并且对其进行分析的系统和方法。

背景技术

本公开涉及多量级光谱纳米显微镜(Multiscale Spectral Nanoscopy)(MSN)，并且总体上涉及美国专利第7,982,194号中的公开内容-单纳米粒子追踪光谱学显微镜(SNTSM)，将其全部内容结合于本文中。在同时将分子交互作用和分子动力学置于它们的大分子生物学背景下，对生物学系统中的这些交互作用的研究长期受到不能在它们自然长度量级(下至<1nm)和与分子动力学有关的时间量级(<毫秒)层面上观察分子现象的阻碍。在上下文中对分子生物进行观察的传统方法为光学成像方法，故以最为普遍使用并且可商购的方法开始：共焦显微术(confocal microscopy)。

传统的成像方法：

当今，激光扫描共焦显微镜具有以高达8Hz提供光学切片(optical section)的能力。不幸的是，这个速度不足以评估三维空间内实时发生的生物学过程。通过尼普科夫转盘(Nipkow spinning disk)的实施方式进一步改善了共焦显微镜，这允许以高达1Hz来获取3D体积并且具有近共焦性能。然而，这样的时间量级(≥1秒)仍过于缓慢以致不能监控细胞或者亚细胞级别上的化学动态。

快速大规模3D成像方法：

为了解决对大体积进行成像的问题，利用高时间分辨率的选择性平面照明显微术(SPIM)，其使用由柱面透镜扩散并且传输给垂直于聚集物镜(collection objective)的样本的激发光束，创建允许用于光学切片的照明平面。尽管轴向分辨率为5微米的数量级，然而，已经实现了每隔6秒对400μm×400μm×200μm体积的神经元动作电位的快速成像。已通过快速扫描激光束来建立照明平面改善了这种方法，从而允许更为密集的照明和更快的获取时间，从而在60秒至90秒内以300nm横向分辨率和500nm轴向分辨率来获取1000μm×1000μm×600μm的体积。

超分辨率(superresolution)方法：

尽管上述方法已经打开了对发展的生物学中的更大动态的研究的大门，然而，其仍受到光的传播光束的衍射性质的限制，且最终分辨率限制于横向维度上的200nm的数量级和轴向维度上的600nm的数量级。为了突破这个限制，已经开发出了所谓的“超分辨率”方法。模拟发射损耗显微术(STED)使用高功率激光脉冲有效地关闭特定区域内的荧光发射。通过使激光脉冲小心地成形以限定焦点周围的球面面积，由于周围环境发光的损耗，有效地在尺寸上减少了焦点尺寸。下降至30nm分辨率的等方性的焦点已被用于使活细胞内的线粒体嵴(mitochondrial cristae)成像。不幸的是，这仍是一种点扫描技术并且在较大空间量级上具有有限的时间分辨率。

其他方法依赖于单个的光可转换荧光团的定位。最初，这些方法(随机光学重构显微术STORM、光激活定位显微术PALM)被实施为用于研究二维空间中的现象，但是，通过使用散光成像术(STORM，横向20nm–30n、轴向60nm)、双面成像术(BP-PALM，横向30nm、轴向75nm)、干涉测量术(iPALM，横向20nm、轴向10nm)、或者实施双螺旋术(DH-PSF，横向10nm、轴向10nm)，已经发展至高达几微米的三维结构。不幸的是，所有这些方法皆受到其轴向长度(通常，仅1-2微米)或者时间分辨率(PALM和STORM需要观察多个光转换事件，从而需要几十秒来获取单个的图像)的限制。