[发明专利]生物合成1，3丁二烯的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年11月30日提交的国际申请号PCT/US2012/067463(该申请要求了2011年12月2日提交的美国申请号61/566,085和2012年10月17日提交的美国申请号61/714,883的优先权)的优先权；以及要求2012年6月15提交的国际申请号PCT/US2012/042757(该申请要求了2012年10月17日提交的美国临时申请号61/714,883；2011年12月2日提交的美国临时申请号61/566,085和2011年6月17日提交的美国临时申请号61/498,408的优先权)的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。

技术领域

本发明涉及生物合成1,3-丁二烯的方法，更具体地涉及使用一种或多种分离的酶如脱氢酶、单加氧酶、去饱和酶、脱水酶和脱羧酶，或者使用表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞合成1,3-丁二烯。

背景

1,3-丁二烯(下文称丁二烯)是用于产生包括苯乙烯-丁二烯-橡胶(SBR)、聚丁二烯(PB)、苯乙烯-丁二烯乳胶(SBL)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(ABS)的合成橡胶、腈橡胶和己二腈的重要单体，所述己二腈用于生产尼龙-66(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。

丁二烯通常作为蒸汽裂解工艺的副产物而产生，其被蒸馏为粗丁二烯流并通过萃取蒸馏纯化(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。已专门采用其他方法制备丁二烯，通过n-丁烷和n-丁烯的脱氢反应(胡得利工艺)；和n-丁烯的氧化脱氢反应(Oxo-D或O-X-D工艺)(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。

工业上，全球95％的丁二烯生产是通过使用石化基原料如石脑油的蒸汽裂解工艺进行的。考虑到较高的生产成本和较低的工艺收率，专门生产丁二烯是没有意义的(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。鉴于对石化原料的依赖以及对于专门生产丁二烯的高能耗催化步骤而言；生物技术通过生物催化提供了一种替代方法。生物催化是使用生物催化剂如酶对有机化合物进行生物化学转化。

因此，在这一背景下，很明显需要生产中间体特别是丁二烯的适宜方法，其中所述方法是基于生物催化剂的(Jang等，Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。

生物来源的原料和石化原料均是生物催化工艺可行的初始原料。

在中碳链长度的酶底物中生成两个乙烯基是通过生物催化工艺合成丁二烯的关键考虑因素。

尚无任何已知的在原核生物或真核生物中合成丁二烯的酶途径。已提出的由生物质-糖生产1,3-丁二烯的三个潜在的途径为：(1)由乙酰基-CoA通过巴豆酰基-CoA；(2)由赤藓糖-4-磷酸；和(3)通过丙二酰基-CoA和乙酰基-CoA的缩合反应。然而，尚无使用这些策略的信息报道(Jang等，Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。

利用原核生物或真核生物合成的最为类似的化合物是2-甲基-1,3-丁二烯(异戊二烯)，其具有短的5碳链长和两个乙烯基。异戊二烯可以通过产生前体二甲基乙烯基-PP的两条路线，即甲羟戊酸(mevalonate)和非甲羟戊酸途径合成(Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2002,66(8),1619-1627)。

甲羟戊酸途径引入了脱羧酶甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(下文称MDD)，其在形成异戊二烯的前体中生成第一个乙烯基(Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2002,66(8),1619-1627)。

因此，可以将甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)标记为在由非天然底物合成丁二烯中的候选酶。