[发明专利]细胞培养

说明书

介绍

本公开内容涉及包含一个或更多个功能化表面的三维[3-D]细胞培养膜的制造，所述功能化表面适于提供适用于分析细胞之增殖、分化或功能的细胞培养条件，所述细胞通常为真核细胞或原核细胞。所述细胞培养膜适用于在现有细胞培养塑料器皿中安装并使用以用于培养细胞，并且还适用于高分辨率显微技术。细胞培养膜的多细胞阵列形式还提供了高效且成本有效的装置来可重复地提供培养物中的细胞，其可用于药物筛选方法。

背景技术

真核细胞(例如哺乳动物细胞)的培养已成为一种常规方法并且明确限定了使细胞能够增殖、分化和发挥功能的细胞培养条件。通常，哺乳动物细胞的细胞培养需要通常由塑料(典型为聚苯乙烯)制造的无菌容器，限定生长培养基以及在一些实例中的饲养细胞和血清。饲养细胞的作用在于提供刺激细胞增殖和/或维持细胞处于未分化状态并且可影响细胞功能的信号。哺乳动物细胞的培养具有多种应用并且存在使用细胞培养来进行实验和研究的多种体外测定和模型；例如细胞在组织工程中的用途；哺乳动物表达系统用于产生重组蛋白的用途以及哺乳动物细胞在初步药物筛选中的用途。

在初步药物筛选中使用哺乳动物细胞以确定先导治疗剂(lead therapeutic)(例如，小分子激动剂或拮抗剂、单克隆抗体、肽治疗剂、核酸适配体、小抑制性RNA)是否具有效力，然后进行动物试验。需要提供改进的细胞培养系统，可在所述改进的细胞培养系统中培养哺乳动物细胞以提供技术上尽可能接近其天然状态的细胞群体，从而能够以可靠的方式分析细胞增殖、分化和功能。

细胞培养系统在本领域是已知的并且技术人员已使用多年。例如，WO2010/005995公开了作为传染病分析平台的微图案(micro-patterned)共培养系统。WO2003/014334公开了体外细胞培养方法，其提供了使得前列腺上皮细胞能够形成与在体内发现的前列腺腺泡非常类似的3D前列腺样腺泡的培养方案。此外，WO00/34454中描述了包含微孔(microcellular)聚合物材料的细胞培养基材(substrate)。这些聚合物形成孔彼此相互连接的网状结构，从而提供细胞可附着至其并增殖的基材。

细胞培养通常包括使细胞在封闭的细胞培养容器中于无菌条件下在单层培养物中生长。一种方法是使用2D蛋白质图案或3D微孔(micro-well)。2D蛋白质图案已成功并广泛地用于控制细胞行为。此外，使用硅蚀刻Si晶片[1、2]、玻璃[3]、聚二甲基硅氧烷[PDMS][4]、弹性印章(elastomeric stamp)[5]、水凝胶(如琼脂糖或PEG)[6、7]、胶原蛋白[8]或Parylen膜[9]和纤维[10]进行的微孔制造已被用于在受限环境中培养单细胞或有限数目的细胞。然而，该技术通常相当于使用微孔作为小型化培养皿而没有利用细胞在孔中的限制以及产生3D蛋白质涂覆的凹穴(nich)的可能性。这主要是因为这样的事实：至少对单细胞培养而言，化学涂层在孔的侧面、顶部和底部不可能不同，并因此仅可为细胞提供单一化学信号，很少观察到优于2D图案化表面的优点。此外，单细胞微孔技术不太适合于高分辨率成像，原因是其经受由细胞和用于形成微孔的材料之间的率变化(例如硅聚合物的折射率为约1.45)所造成的图像失真[11]。

例如而非限制性地，使用原代肝细胞来举例说明本公开内容。我们的3D差异性表面涂层允许培养原代肝细胞作为具有可用于药物代谢分析的受控胆小管[BC]形态的细胞双联体(doublet)。我们的技术使得功能原代肝细胞能够在双联体水平培养至少96小时。此外，我们的技术提供可包括在任意标准细胞培养装置中的通用独立膜。本文公开的细胞培养系统可用于哺乳动物细胞以提供用于产生更接近地反映体内条件的细胞培养物的设备，从而提供应用于例如组织工程、重组蛋白生产和药物筛选的更可靠的细胞培养系统。

发明陈述

根据本发明的一个方面，提供了三维细胞培养基材，其包含：包含适于细胞培养之经固化聚合物的穿孔膜，其特征在于所述膜具有至少两个经改性细胞培养表面，其中第一表面包含至少一种细胞培养剂并且第二表面包含第二种不同的细胞培养剂，其中所述膜增强与所述膜相缔合之细胞的增殖和/或分化或功能。

在本发明的一个优选实施方案中，所述膜包含多个穿孔，其中所述穿孔的直径为至少5μm至1000μm；优选直径为约20μm至300μm。

纵横比(aspect ratio)通常被认为是外形(feature)的高度与特征性横向尺寸之间的比例关系。在本公开内容的上下文中，关于穿孔尺寸，纵横比通常不大于2。